2013—2018年我国H9亚型禽流感分子流行病学监测

禽流感（Avain influenza，AI）是由禽流感病毒（AIV）引起的禽类全身性或呼吸系统性疾病。AIV 属于正黏病毒科 A 型流感病毒属，其关键致病性基因为 HA 基因。在宿主胰蛋白酶的作用下，HA 基因能裂解为 HA1 和 HA2，因而产生具有感染性的病毒粒子。

根据对禽类致病性的不同，AI 又分为高致病性（High pathogenic AI，HPAI）和低致病性（Lowpathogenic AI，LPAI）或温和性（Mildly pathogenicAI，MPAI）。MPAI 虽然对禽类的致病性较弱，但其基因来源复杂、分布广，又易继发其他致病微生物感染，对养禽业具有潜在危害，尤其是 H9 亚型。目前监测发现，有些毒株的基因组已发生了多元重组，基因片段来源也多样化。因此，有必要实时监测当前 H9N2 亚型 AIV 流行毒株 HA 基因的遗传变异情况。本研究对 2013 年到 2018 年 4 月河北、河南、江苏、安徽、山东、湖南、吉林和四川等省份养殖场采集的鸡群喉、泄殖腔拭子以及疑似病料进行了 H9 亚型 AIV 病原学检测，对其 HA基因进行扩增、测序与分析，绘制了系统进化树并进行了分子遗传进化分析，为 H9 亚型 AI 防控提供理论依据。

1　材料与方法

1.1 样品来源

采集 2013—2018 年我国河北、河南、江苏、安徽、山东、湖南、吉林和四川等 15 个省份养殖场疑似流感暴发鸡群的喉、泄殖腔拭子以及病料样品。

1.2 主要试剂和仪器

RNA 提取试剂盒：购自天恩泽生物公司；HiScript®II One Step RT-PCR Kit：购自诺唯赞生物公司；DNA Marker DL2000：购于宝生物工程（大连）有限公司。

超净工作台（北京东联哈尔 -DL-CJ-1NDII），低温冷冻离心机（湖南湘仪 TGL-6），PCR 扩增仪（美国 Bio-rad T100），微波炉（格兰仕）和紫外光凝胶成像系统（培清 -JS-680C）。

1.3 引物

按照农业行业标准《禽流感病毒 RT-PCR 试验方法》（NYT772-2004）中的 H9 亚型 AIV RT-PCR检测方法，选用 H9-732U/H9-732L 特异性引物，扩增H9 亚型血凝素基因片段。引物序列如下：H9-732U5'-TCAACAAACTCCACCGAAACTGT-3'；H9-732L5'-TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA-3'。引物由北京华大基因科技有限公司合成。

根 据 GenBank 上已经发表的 AIV 毒株 参 考 序 列， 设 计 扩 增 HA 全长基因片 段 引 物。 设 计 的 引 物 序 列 为： 上 游5 '-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG-3'；下游5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3'。引物由北京华大基因科技有限公司合成。

1.4 病毒 RNA 提取

参照天恩泽 RNA 提取试剂盒说明书，具体如下：取组织研磨液 200 µL，加 1 000 µL 溶液 A，混匀；加 200 µL 氯仿溶液，震荡混匀，12 000 r/min，4 ℃离心 10 min；小心吸取水相 600 µL 加入到新的DEPC 处理过的 1.5 mL 离心管中；加等体积的溶液 B混匀，分两次加到离心吸附柱中，12 000 r/min，离心30 s；弃穿透液，加 700 µL 洗液，12 000 r/min，离心30 s；弃穿透液，12 000 r/min，空离 30 s；将离心柱转移至新的 DEPC 处理过的 1.5 mL 离心管中，加 60 µL洗脱液，12 000 r/min，离心 30 s，得到 RNA，−20 ℃保存备用。

1.5 HA 基因 RT-PCR

采用 HiScript®II One Step RT-PCR Kit 试剂盒，进行 RT-PCR 反应。反应条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 45 s，33 次循环，72 ℃ 10 min。

1.6 基因序列测定

将 PCR 产物送往北京华大基因科技有限公司进行测序。

1.7 H9 亚型毒株分子进化分析

利 用 NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）中的Influenza virus resource 数据库，搜索 H9 亚型 AIVHA 基因序列，并同测序结果进行 Alignment 在线对比，然后利用 MEGA 7.0 软件，绘制进化树，选取代表毒株进行 HA 基因分子演化分析，了解近年来我国 H9 亚型 AIV 毒株 HA 基因的演化特点。

2　结果

2.1 HA 区域核苷酸及推导氨基酸同源性分析

通过 PCR 产物纯化测序和序列拼接，得到80 个毒株的 HA 基因开放阅读框，其中 2013 年11 株，2014 年 15 株，2015 年 8 株，2016 年 18株，2017 年 17 株，2018 年 11 株。BLAST 检索发现，80 株 H9 亚型 AIV HA 基因核苷酸同源性为85.4%~99.6%，氨基酸同源性为 85.9%~99.9%。

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