非洲猪瘟分子病原学及分子流行病学研究进展

Malmquist等[21] (1960) 提出并建立了血细胞吸附试验方法, 血细胞吸附是指猪的红细胞附着在感染ASFV的单核细胞或者巨噬细胞的表面。绝大多数从非洲分离的ASFV毒株以及最初从欧洲国家分离的ASFV毒株均产生猪红细胞吸附现象。Pan等[22] (1978) 应用免疫过氧化物酶噬斑染色技术, 对接种ASFV的Vero细胞进行检测, 3d后观察到噬斑。可对ASFV进行抗原定量分析。此方法快速、特异, 不用借助其他仪器, 肉眼便可观察结果。Pastor等[23] (1992) 用细胞质可溶性抗原CS-P, 建立了斑点免疫 (DIA) 检测方法, 敏感性与OIE推荐的ELISA方法相当。Marco等[24] (2007) 建立了免疫组化法, 用来检测急性感染ASFV猪的扁桃体组织病理学变化, 通过检测发现, 感染ASFV猪有出血、单核细胞增多现象。免疫组化法是通用的检测方法之一, 但对于临床症状不明显的病例, 确诊有一定难度, 因此, 该方法仅作为ASFV的辅助检测方法。

3.4.2、分子生物学检测方法

3.4.2.1 PCR

PCR具有简单快速、灵敏度高和特异性强的优点, 是目前ASFV最常用的实验室检测方法。Aguero等[25] (2003) 和曾少灵等[26] (2009) 先后根据ASFV VP72基因设计引物, 建立了ASFV的PCR检测方法, 均具有良好的敏感性和特异性, 可以检测出极低含量的ASFV, 为ASFV早期感染的快速诊断提供了有效的分子生物学检测方法。Aguero等[27] (2004) 和张倩[28] (2010) 先后建立了一步法多重RT-PCR方法, 能够鉴别诊断猪瘟病毒 (Classical Swine Fever Virus, CSFV) 和ASFV, 可以从临床样品 (如抗凝全血、细胞培养物和组织) 中检测到病毒, 这为早期快速、特异性诊断非洲猪瘟和猪瘟提供了可靠的方法。Basto等[29] (2006) 建立了检测蜱ASFV的套式PCR方法, 敏感性高于OIE推荐的PCR检测方法。Giammarioli等[30] (2008) 建立了检测CSFV、ASFV、猪圆环病毒2型 (PCV2) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 和猪细小病毒 (PPV) 5种病毒的多重PCR检测方法, 可以用于这5种病毒感染的鉴别诊断。崔尚金等[31] (2012) 建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法, 该方法采用纳米金颗粒作为热导介子, 提高了PCR反应效率。敏感性试验表明, 纳米PCR是常规PCR检测技术敏感性的1, 000倍以上, 最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。采用该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份临床送检的69份样品进行检测, 结果均为阴性, 表明该地区均无ASFV感染情况。

3.4.2.2 荧光定量PCR

实时荧光定量PCR比常规PCR具有更高的敏感性和特异性, 可同时快速检测大批量样品。King等[32] (2003) 、李维彬等[33] (2007) 、张泉等[34] (2007) 、黄萍等[35] (2010) 、Tignon等[36] (2011) 、李洪利等[37] (2012) 先后根据ASFV VP72基因, 曾少灵等[38] (2010) 根据VP73基因, 董志珍等[39] (2009) 根据P54基因各自设计引物和探针, 建立了Taq Man实时荧光定量PCR方法。Mc Killen等[40] (2007) 建立的实时荧光定量PCR分子信标 (molecular beacon) 技术具有快速、特异性强、灵敏性和准确性高的特点。该检测方法可快速鉴别PRV、ASFV、PCV2和PPV。郭少平等[41] (2010) 根据ASFV K205R基因序列设计合成引物及Taq Man探针, 建立了基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR检测方法。Mc Killen等[42] (2010) 根据9GL基因建立了MGB探针实时荧光定量PCR检测方法, 最低可以检测到20拷贝标准DNA。该方法检测临床样品中的ASFV, 敏感性与OIE推荐Taq Man荧光定量PCR方法相当。Fernandez等[43] (2013) 利用通用探针库建立了ASFV的实时荧光定量PCR方法。陈静静等[44] (2012) 建立了双重荧光定量PCR, 可同时检测CSFV和ASFV, 只需一步即可完成, 可作为鉴别两种病毒的诊断方法。王建华等[45] (2016) 根据ASFV CP530R基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 (HP-PRRSV) NSP2基因为靶序列, 分别设计特异性引物和Taq Man-MGB探针, 建立了一种可同时鉴别检测ASFV和HP-PRRSV的二重荧光定量RT-PCR方法。

3.4.2.3 重组酶聚合酶扩增 (RPA) 技术

RPA是一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术, 该方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠, 王建昌等[46] (2016) 基于ASFV VP72基因保守序列设计并合成引物, 建立了ASFV RPA等温检测方法, 为ASFV的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

3.4.2.4 线性指数聚合酶链式反应 (LATE-PCR) 技术

LATE-PCR是不对称PCR的一种形式, 该方法用于检测组织样品的病毒, 其敏感性可以达到大约1拷贝的病毒DNA。Ronish等[47] (2011) 基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法, 为ASFV的实验室诊断提供了敏感的检测方法。

3.4.2.5 环介导恒温扩增 (LAMP) 技术

LAMP技术操作简单、灵敏、快速, 检测成本远低于荧光定量PCR, 且不需要特殊仪器设备, 具有较高的临床实用性。江彦增等[48] (2009) 、王彩霞等[49] (2010) 、杨吉飞等[50] (2011) 先后根据ASFV VP72基因序列设计引物, 建立了快速检测ASFV的LAMP方法, 最低检测限可达10拷贝质粒DNA, 且具有良好的特异性。邬旭龙[51] (2014) 根据ASFV K205R基因序列设计引物, 建立了LAMP检测方法。LAMP方法不需要PCR中的变性、退火步骤即可进行靶序列的循环扩增, 不但大大缩短了时间, 且使反应能够在恒温条件下进行, 无需特殊仪器设备, 肉眼判读, 可以满足基层快速诊断的需要, 非常适合于基层兽医实验室和养殖场使用。

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