塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术（RPA）实时荧光检测方法的建立

2.2　实时荧光 RPA 反应条件优化

为了筛选反应最佳温度和最适时间，特选取35、37、39、40、42 ℃下，最长反应 15 min，检测浓度为 2.8×103 拷贝 /μL 样品的 RPA 扩增情况。结果显示，反应温度越高，随着反应时间的推移荧光强度上升越快，温度为 40 ℃和 42 ℃时，在 6min 内荧光强度即超过 1 000 mV。而在 3 次重复实验中，40 ℃的重复性好于 42 ℃（图 2）。因此本研究选择 40 ℃为本方法的工作温度。

 图2　不同温度条件下 RPA 反应

在 40 ℃的条件下，利用组合 3 引物探针，将拷贝数为 2.8×106~2.8×100 拷贝 /μL 的 7 个稀释度标准品和 ddH2O，作为阴性对照扩增 20 min，结果显示，扩增 10 min 时，浓度为 28 个拷贝 /μL 样品的测定结果为阳性。当扩增 20 min 时，2.8 拷贝/μL 样品荧光强度值缓慢提升到 1 000 mV。阴性对照从实验开始至结束一直未出现明显扩增。因此，本实验选择 10 min 作为扩增设定时间，检出限为28 个拷贝 /μL（图 3）。

图 3　不同浓度质粒标准品 RPA 反应时间

2.3　特异性试验

为了确定 RPA 方法的特异性，选取浓度为2.8×105、2.8×101 拷贝 /μL SVV 阳性标准品以及FMDV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV 的 cDNA进行反应，cDNA 浓度均为 10 ng/μL，用量为5 μL。结果表明，随着反应时间的推移，反应 10min 后，SVV 阳性标准品荧光强度明显升高，相比之下，其他病毒阳性 cDNA 测得的荧光强度无明显升高变化，说明本方法可以特异性扩增 SVV核酸，可用于 SVV 的检测（图 4）。

图 4 SVV 实时荧光 RPA 的特异性试验

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