影响血凝和血凝抑制试验结果的几个重要因素

血凝（HA）及血凝抑制（HI）试验是目前我国对禽类疾病进行流行病学调查、疫病诊断、免疫监测等工作的主要手段，该试验虽然操作简便，但每一步操作都会直接影响最终结果的判定。本文总结了笔者在工作及学习过程中所整理的一些比较重要的影响因素。

1、红细胞悬液的影响

差值法配制1%鸡红细胞悬液：采集2-6月龄SPF健康公鸡的血液，与等量阿氏液混合，将血液配平放入离心机中，2000转／分钟离心10分钟。共离心三次，第一次和第二次离心结束后，将上清液倒掉，第三次离心结束后，不要晃动离心管，用注射器、吸管或移液枪将上清液除去，尽量去除干净。用1000ul移液枪向离心管中加入5ml生理盐水（或PBS），然后混匀离心管中的液体。用1000ul移液枪将离心管中的液体移入干净的瓶子中，记下毫升数A。A与5的差值B就是鸡红细胞的数量，按照1%比例向瓶子中加入相应量的生理盐水（或PBS），配成1%的鸡红细胞悬液。

如果红细胞浓度偏高，则血凝价可能偏低，血凝抑制价可能偏高；如果红细胞浓度偏低，则血凝价可能偏高，血凝抑制价可能偏低。

2、抗原凝集价的测定

血凝试验测抗原凝集价：在微量板上，从第1孔至12孔或所需之倍数孔，用移液器每孔加入PBS（生理盐水）25ul 。用移液器吸取被测抗原25ul，从第1孔起，依次做2倍系列稀释，至第11个孔弃去移液器内25ul液体。每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，在最后1列设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振摇器上摇匀，置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟。当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度作为判定终点。抗原凝集价的测定直接影响下一步试验中4HAU血凝素配制的准确程度。

3、4HAU血凝素的影响

将配制好的4HAU血凝素用PBS（生理盐水）稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7，在每一稀释度的25ul体系中加入25ul PBS（生理盐水），再加入1%鸡红细胞悬液25ul，摇匀，置室温20~40分钟或置2~8℃40~60分钟判定结果。如果前2孔100%凝集，第三孔50%凝集，说明4HAU血凝素准确。如果4HAU的血凝素液偏高，则测定的血清抗体效价可能偏低；如果4HAU的血凝素液偏低，则测定的血清抗体效价可能偏高。

4、血凝抑制试验结果判定的影响

试验过程中，建议在微量板的中间划一条竖线以便于读数时能快速识别结果所对应的列数。当红细胞对照孔中的红细胞流淌到血凝抑制平板底部时，马上读数，只要血清样品中的红细胞流淌的状态没有达到红细胞对照孔的标准，则不予读取。读数速度要快且只能读取一遍。

5、试验过程中移液器使用的影响

（1）容量设定

移液器在容量设定时，当我们从大值调整到小值时，刚好就行；但从小值调整到大值时，就需要调超三分之一圈后再返回，这是因为计数器里面有一定的空隙，需要弥补。

（2）预洗吸头

在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需要转移的液体吸取、排放两到三次，这样做是为了让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度，使整个移液过程具有极高的重现性。其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在白套筒室内形成负压，从而产生漏液的情况，这时就需要我们预洗四到六次，让白套筒室内的气体达到饱和，负压就会自动消失。

（3）吸液

先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面，浸入的深度为：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米，P5ML、P10ML小于或等于4毫米(浸入过深的话，液压会对吸液的精确度产生一定的影响，当然，具体的浸入深度还应根据盛放液体的容器大小灵活掌握)，平稳松开按钮，切记不能过快。

（4）放液

放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点，这样做可以确保吸头内无残留液体。如果这样操作还有残留液体存在的话，就应该考虑更换吸头了。

千里之堤，溃于蚁穴，小小的误差，积少成多便是错误，试验的结果也将截然不同。所以在血凝及血凝抑制试验中，一定要细致耐心，严格按照SOP进行操作，同时综合考虑各方面因素，发现问题及时纠正处理，这样才会获得满意的、准确的结果！