王楠、王作友等 （吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春 130062） 摘要：应用γ干扰素试验、胶体金试纸条对100头奶牛进行试验，采集这100头奶牛的肝素抗凝全血及血清，经全血培养、抗原刺激，用γ干扰素试剂盒检测上清，用胶体金试纸条检测血清。同时应用传统皮内变态反应、欧盟比较皮内变态反应，对这100头奶牛进行检测，3d后观察结果。在100头被检测的奶牛中，传统皮内变态反应检出结核阳性36头，欧盟比较皮内变态反应检测出结核阳性13头，两种γ干扰素试验试剂盒分别检出结核阳性12头和10头，两种胶体金试纸条分别检出结核阳性11头和9头。
关键词：奶牛结核病；皮内变态反应；干扰素试验；胶体金试纸条
近年来，我国奶牛养殖规模不断扩大，牛结核病的流行对奶牛养殖业和公共卫生安全的威胁日益突出，《国家中长期动物疫病》（国办发〔2012〕31号）将牛结核病列为优先防治病种之一。控制牛结核病的传播和蔓延，主要措施是及时检出和扑杀病牛，然而，牛结核病净化必须依赖快速、敏感、特异和准确的诊断方法。结核菌素皮内变态反应建立至今已120余年，目前仍是各国及国际动物卫生组织(OIE)指定的法定检疫方法。该方法虽然敏感性高，但仍存在与环境分枝杆菌存在交叉反应、操作时间长（需 3d以上）、劳动强度大、难以普查、结果决断主观性强等缺陷。如何在牛结核病净化工作中，提高特异性以避免淘汰假阳性牛，提高敏感性避免保留假阴性牛十分重要。
本研究采用结核菌素皮内变态反应、牛γ干扰素(IFN-γ) 释放反应、酶联免疫吸附实验、免疫胶体金方法，来探寻不同诊断方法的优缺点，提高牛结核的阳性检出率。
1 材料与实验动物
1.1 材料
1.1.1 国产牛 PPD：购自哈药集团生物疫苗有限公司。
1.1.2 欧盟 PPD：购自北京瑞翔合生物科技有限公司。
1.1.3 BOVIGAM 牛结核分枝杆菌γ干扰素检测试剂盒：购自北京瑞翔合生物科技有限公司。
1.1.4 牛结核分枝杆菌 Rv3872/CFP-10/ESAT-6 融合蛋白检测试剂盒：由本实验室自行制备。
1.1.5 牛结核抗体快速检测试纸条：分别购自上海快灵生物科技有限公司，武汉科前动物生物制品有限责任公司。
1.2 实验动物 吉林省某奶牛场100头奶牛。
2 方法
2.1 牛结核菌素皮内变态反应试验
参照依据中华人民共和国国家标准一动物结核病诊断技术（GB/T18645-2002）进行。
2.2 欧盟皮内变态反应比较试验
与牛 PPD 变态反应试验相同，在注射牛PPD同时，在牛的颈部另一侧对应部位 (或在颈部同一侧，但两次注射的位置间隔大约为12～15cm)，72h后观察结果。注射前和试验结果测量应由同一个人完成。
2.3 牛结核病γ干扰素检测试验
采集5 ～ 10mL全血样品置肝素抗凝管，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加四个孔，每孔加1.5 mL分装的抗凝血。无菌加入100mLPBS (阴性抗原对照)，禽PPD、牛PPD、牛结核分枝杆菌 Rv3872/CFP-10/ESAT-6 融合蛋白至相对应孔，并充分混匀。将含有血液和抗原的组织培养板在 37℃湿温培养箱中孵育16～24h，用可调移液器小心吸取约400 L的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中。
2.4 牛结核分枝杆菌免疫胶体金试验
被检血清按照说明书操作，分别滴入2～3滴血清至检测孔内，规定时间内观察结果。
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