1．8 单抗包被条件和多抗作用条件的确定
采用方阵滴定法，将筛选的单抗和多抗分别按最佳使用浓度稀释，单抗采用37℃2 h、4℃12 h、4℃24h和37℃1 h后4℃ 12h4种包被条件，多抗则采用37 ℃分别作用2h、1 h和30min的工作条件，按1．7步骤进行ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，根据结果选择单抗的最佳包被条件和多抗的最适作用条件。
1．9 封闭剂的应用选择
用单抗包被酶标板，分别用1％BSA、1％明胶、1％BSA+1％明胶、1％BSA+1％明胶应用2次(单抗包被后和待检抗原作用后)4种方式封闭，然后按1．7步骤进行ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，根据结果选择封闭剂的最佳应用方法。
1．10 酶标抗体工作条件的选择
酶标抗体分别按1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀释，反应条件为37℃分别作用2h、1 h和30min，按1．7步骤进行ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，根据结果选择酶标抗体的最佳工作浓度和作用时间。
1．11 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定
以24份来自健康牛的脾脏组织悬液为待检测样品，进行上述AC—ELISA。每份样品重复2孔，在样品OD450值符合正态分布的条件下计算样品平均OD450值(x)和标准差(s)，按文献计算阴性样品的临界值。
1．12 AC-ELISA重复性试验
用单抗包被4块酶标板，在每一块板内分别检测1份BVDV细胞培养抗原和4份牛病毒性腹泻病组织病料，同时用1份正常细胞培养物做阴性对照，每份样品在每块板中重复4孔，AC-ELISA方法进行检测。结果用SPSS软件进行统计学分析，计算样品OD450值在不同板间和板内不同孔间的变异系数，检验板内和板间检测样品的重复性。
1．13 AC-ELISA在临床牛病毒性腹泻病样品检测中的应用
11份临床牛病毒性腹泻病疑似病例脾脏组织和12份健康牛脾脏组织，分别研磨匀浆后用1％NP-40处理，用AC-ELISA方法检测BVDV抗原，同时用正常细胞培养物做阴性对照。上述样品分别用病毒分离和RT-PCR方法平行检测做对比。
2 结果
2．1 单抗纯化鉴定和浓度测定
纯化前后的单抗SDS-PAGE如图1，由图可见纯化后的单抗在68 ku和25 ku附近有两条明显的条带(分别是IgM的重链和轻链)，与预期的大小条带相符。而未纯化的泳道上出现多条杂带。表明单抗纯化结果较理想。
2．2 多抗效价测定、纯化和浓度测定
采用倍比稀释法测得纯化后的多抗效价为1．2X10 4。纯化前后的多抗SDS-PAGE如图2，图中显示IgG在50ku和25 ku附近出现了明显的条带，代表IgG的重链和轻链，与预计大小相符，未纯化多抗则有很多杂带。表明上述纯化结果很理想。经BCA试剂盒方法测定多抗的浓度为9．08 mg／mL。
2．3 单抗和多抗最佳使用浓度的筛选
方阵滴定法筛选单抗和多抗最适工作浓度，结果见表1。单抗4G3和兔抗BVDVIgG浓度分别为5和10μg／mL时，检测BVDV细胞培养抗原的OD450值为1．023，接近于1．0，且正常细胞培养物的OD450值为0．312，P／N值(3．278)最大，确定AC—ELISA试验中单抗和多抗的最适工作浓度分别为5和10μg／mL。
2．4 单抗包被条件和多抗作用条件的确定
以最适单抗浓度采用37 ℃ 2h、4 ℃ 12h、4 ℃24h和37℃1 h后4℃12h4种包被条件，多抗则采用37℃分别作用2h、1 h和30 min 3种不同的工作条件，组成方阵进行AC-ELISA，分别检测NP-40处理的阴、阳性抗原，结果见表2。
单抗在4℃包被12 h，多抗在37 ℃作用1 h，BVDV阳性抗原OD450值1．032，阴性OD450值0．320，P／N值为3．225；单抗在4℃包被24 h，多抗在37℃作用1 h，BVDV阳性抗原OD450值1．066，阴性OD450值0．315，P／N值为3．384。此两种条件下的阳性抗原OD450值均接近1．0，P／N值均较大，单抗在4℃包被12—24h，多抗在37℃作用1 h可作为双抗体的最佳反应条件。
2．5 封闭剂的应用选择
分别用1％BSA、1％明胶、1％BSA+1％明胶、1％BSA+1％明胶应用2次(单抗包被后和待检抗原作用后)4种方式封闭后进行AC-ELISA，分别检测NP-40处理的OD450值BVDV阴、阳性抗原，结果见图3，用1％BSA+1％明胶封闭2次，阳性抗原OD450值最高，阴性抗原OD450值最低，P／N值最大，为最佳封闭条件。
2．6 酶标抗体的工作浓度和工作时间的选择
羊抗兔IgG分别做1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000倍稀释，在37℃分别作用2h、1 h和30 min，进行AC-ELISA，检测NP-40处理的BVDV阴、阳性抗原，结果见表3，酶标抗体按1：10000稀释后37 ℃作用1 h，测得BVDV阳性抗原OD450值最高，阴性抗原的OD450值较低，P／N值较大，为最佳反应条件。
2．7 AC-ELISA方法阴性样品临界值的确定
用AC—ELISA方法检测24份BVDV阴性的牛组织样品，其OD450值介于0．242和0．346之间(图4)。用SPSS 8．0软件进行统计学分析，24份样品的OD45。值符合正态分布，OD450值的平均数(x)和标准差(s)分别为0．301和0．031，根据文献计算阴性样品的临界值为x+3xs=0．393。根据统计学原则，OD450值>0．393时，可以在99．9％的可信度上判定为阳性，能够作为检测结果的判断标准。为了减少假阳性或假阴性结果，将临界值加上和减去1个标准差的范围作为一个可疑区间(即OD450值0．362—0．424)，介于可疑区间内的结果需要重检。
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