上海地区野鸟中禽流感的流行病学监测

禽流感是由禽流感病毒所引起的一种急性和高度接触性传染病，几乎所有的野生和家养禽类都可感染。2003年底从亚洲始发并席卷全球的禽流感疫情中，泰国等国家从多种死亡野鸟体内分离到了H5N1禽流感病毒。2005年4月，我国青海湖中的近6000只斑头雁等侯鸟发生急性死亡，经病毒分离和鉴定，证实病原体为H5N1亚型禽流感病毒。因此，目前不少学者都认为野生鸟类在传播禽流感病毒过程中扮演了重要角色。

上海处于中纬度地区，又是亚太地区候鸟迁徙路线上的重要中转站，目前记录到的鸟类有379种，另有45个亚种。借助于特殊的地理位置和丰富的湿地资源，使上海辖区成为大量鸟类春、秋二次迁徙途中逗留、补充营养的驿站，以及冬季的越冬地。每年在此停留或经过的野生鸟类达100万之多，候鸟种类为总体的83.75%，与留鸟相比占了绝对优势。对于这些野生鸟类(包括侯鸟和留鸟)，目前尚缺乏有效的免疫与疫病监控措施。鉴于此，我们于2004年4月—2005年6月对捕捉到的野鸟进行了禽流感的流行病学监测，以期为有效控制或预防禽流感疫情的发生提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测禽流感病毒抗体的血凝和血凝抑制(HA和HI〕试验诊断试剂来源于中国农科院哈尔滨兽医研究所。

1.1.2 检测禽流感病毒抗原的荧光RT-PCR试剂来源于北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

1.1.3 用于病毒分离的SPF种蛋来源于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1样品的采集

在上海市崇明、奉贤、南汇海塘及上海动物园、上海野生动物园等野鸟栖息地，雇佣当地猎户捕捉野生鸟类，同步采集野鸟的血样和喉肛棉拭样品，采集样本后放飞野鸟。血样采用受体破坏酶（RED）去除待检血清中的非特异性抑制素，将4容量的RED加入1容量的血清中，37℃水浴16—18h，然后56℃水浴50分钟（破坏残余RED的活性）。4000转/分钟转速离心后取上清，再加入终浓度为10%的测定用鸡红细胞悬液，摇匀，4℃过夜，1000转/分钟离心5分钟，取上清置于-20℃冰箱冻存备用；棉拭样品置于含有抗菌素的pH 7.4~7.6 Hanks氏液的采样管内。棉拭样品及时送至实验室后，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。然后用灭前毛细吸管反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液。置4℃待其自然沉淀5——10分钟，离心取上清备用。应尽快进行接种分离，48小时内能进行接种可置4℃保存，如未能接种应置小于等于70℃下保存。

1.2.2 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验

按国标《高致病性禽流感诊断技术》进行，待检血清样品HI滴度5log2判为阳性。

1.2.3 荧光RT-PCR操作程序

按国标《H5亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法》进行，待检样品无Ct值并且无扩增曲线为阴性；Ct值小于等于30.0，且出现典型扩增曲线为阳性。

1.2.,4 MDCK细胞培养

将己经长成片的MDCK细胞弃生长液，用Hanks氏液洗两遍，将残余的牛血清洗净，每瓶加入己处理的棉拭样品0.5—1毫升（接种量要根据瓶的大小)，一般2瓶/样品，轻晃细胞瓶，使样品完全履盖细胞，置35℃吸附1—2h弃上清液，再用Hanks氏液洗1——2遍，每瓶加入3 毫升（随瓶的大小而异）维持液（不含小牛血清，而含终浓度为2ug/mL胰酶的Eag1e液)，置37°C培养；次日起每天观察有无细胞病理变化(CPE);当CpE出现+++——++++号时，即75—100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可将细胞冻融1—2次以提高收获样品的病毒滴度。由于APE具有非特异性，因此对收获的维持液进行HA试验以鉴定病毒。如HA阴性，应在MDCK细胞上盲传一代，如HA仍为阴性，则终定为阴性样品。

1.2.5 鸡胚培养

已处理的棉拭样品经尿囊腔接种于9—11日龄SPF鸡胚，每胚0.2毫升，每个样品接种5个胚，置37°C温箱孵育，每天观察鸡胚两次，弃去24h内死亡鸡胚，及时收集之后死亡鸡胚，至96h收集所有鸡胚，置于4°C冰箱内过夜，收获鸡胚尿囊液作HA测定，阴性者再盲传1代，如HA仍为阴性，则终定为阴性样品。

2 结果

2.1 样品采集

于2004年4月至2005年6月间，在上海的南汇海塘地区、奉贤海塘地区、崇明东滩湿地保护区、上海动物园和上海野生动物园等野鸟栖息地共捕捉到1010只野鸟，并同步采集了野鸟的血样和喉肛棉拭样品。其中，林鸟3种，数量为377只；鹃鹏类26种，数量为403只。秧鸡类2种，数最为4只；鹭科鸟类2种，数量为36只；鸭科鸟类9种，数量为188只；毕鹏科鸟类1种，数最为2只。

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