疫病监测
琼脂扩散试验操作方法
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琼脂扩散试验，是根据沉淀试验的原理,抗原和抗体可在琼脂凝胶中扩散,并由近及远形成浓度梯度，当抗原、抗体的特异性互相对应时,它们在琼脂基质中适合比例下相遇,便可相互结合,形成抗原-抗体的结合物,分子量相应增加,颗粒变大,故在琼脂凝胶中不再扩散,在抗原、抗体比例较适合的位置上形成白色可见的沉淀线,此种沉淀反应,称为琼脂免疫扩散试验，简称"琼扩"。本法可用已知抗原测定未知抗体,反之亦然。在猪病的实验室诊断中，常用于猪伪狂犬病的抗体检测,也曾有用此法检查猪瘟、猪水疱病和猪痘等疾病的报道。现以检测伪狂犬病的抗体为例，将其操作方法介绍如下。 (1)材料 伪狂犬病标准琼扩抗原,阳性血清,阴性血清, 待检血清(56℃灭能30分钟),生理盐水,打孔器,微量移液器,培养皿,琼扩琼脂(配制方法：含有0.1%石炭酸的磷酸缓冲盐水,加入1%的优质琼脂,在沸水中融化均匀,若有杂质, 须用纱布过滤,然后分装于盐水瓶内,保存备用)。 (2)操作 ①浇琼脂板和打孔 将已融化的琼脂趁热倒入平皿,制成3毫米厚的琼脂板,待凝固后进行打孔。一组共7个孔,中间l孔,周围6孔。用打孔器打孔,剔出孔内的琼脂,然后将琼脂板在酒精灯上来回过 2－3次,使琼脂与玻板之间的空隙封闭。 ②向孔内加样 中央孔加抗原,外周孔第1,5孔加阳性和阴性血清作对照,第2,3,4,6孔加待检血清。将加完样的琼脂平皿合上盖子,置37℃恒温箱扩散24－36个小时,然后判定结果。 ③结果判定 首先检查标准阳性血清孔和抗原孔之间是否出现明显的致密的白色沉淀线5的，而阴性孔则不出现,只有在对照组出现正确结果的前题下,被检孔才可参照标准判定。 ④注意事项 第一,琼扩所用的琼脂必须是优质的琼脂粉,若用普通的琼脂条,应事先进行净化精制。精制的简易方法是：取条状琼脂24克,加蒸馏水1 000毫升,在沸水中融化,趁热倒入搪瓷盘中,待冷却后切成1平方厘米大小的琼脂块,用蒸馏水或无离子水浸泡2－3天,每天换水4－5次，然后将处理好的琼脂块隔水融化,加入0.1%石炭酸磷酸缓冲盐水,配成1%琼脂。 第二,制备琼脂板应在水平台上进行,防止产生厚薄不匀。板的厚度要求一致(7.5厘米的平皿,用15毫升琼脂液)。 浇制时防止产生气泡。平皿浇制的琼脂板在4℃冰箱内可保存15天。 第三,打孔的孔径、孔距力求准确、合适。 第四,加滴孔中的抗原和血清时,孔内必须加满而又不能外溢。加样时不能带进小气泡。 |
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