猪冷冻精液研究应用进展及问题分析与展望

3.1 冷冻前对公猪抗冻性进行筛选

传统的精子评定方法无法预测精液抵抗冷冻的能力，因此需要研究者专注于抗冻性标记的筛选与鉴定，抗冻性标记被定义为在开始冷冻保存之前，那些可能允许在新鲜/稀释精液中鉴定GFE和PFE的标记（蛋白质或非蛋白质）。

研究发现，精子的卵母细胞结合蛋白GSTM3、白蛋白（ALB）和蛋白质二硫化物异构酶家族A成员4（PDIA4）、热休克蛋白90（HSP90AA1）、顶体蛋白结合蛋白（ACRBP）、磷酸丙三糖异构酶（TPI）、电压依赖性阴离子通道蛋白2（VDAC2）等精子蛋白的相对含量与冻融精子质量参数之间存在显著相关性，可作为新的抗冻性标记。

在基因组水平上，猪GFE和PFE组之间存在多达16个潜在的遗传标记，这表明遗传差异可能是这些抗冻性差异的基础。这一发现似乎并不是猪独有的，因为HSP70 191位的单核苷酸多态性，特别是C>G，与山羊较高的精子抗冻性也相关。

另外，添加来自GFE的精浆蛋白增加了PFE的抗冻性，说明精浆中存在某些抗冻性成分，用差分凝胶电泳（DIGE）比较了GFE和PFE组精浆蛋白质组的差异，发现纤连蛋白1（FN1）可作为公猪精液的抗冻性标记。另一种似乎赋予公猪精液更高低温耐受性的精浆蛋白是N-乙酰-β-己糖胺酶，精液解冻后该蛋白的活性与精子活力、活力和脂质过氧化呈负相关，因此公猪精浆中较高水平的N-乙酰-β-己糖胺酶活性与精子低温耐受性低有关。

基于目前的研究进展，亟需对猪精子抗冻性标记进行筛选和大群验证，随着高通量技术的发展，可以利用SNP芯片可以在公猪群体种进行选育，但存在的障碍是抗冻性蛋白是否存在种间的差异和公猪群体规模，因此需要国内各机构联合协作，尽早确定切实有效的抗冻性标记，用于公猪早期选育。

3.2 深入开展冷冻损伤机制的研究

众所周知，细胞代谢在低温下会降低，正是利用了这一特点，才可以在冷冻条件下长期保存生殖细胞、胚胎和组织。

精子细胞和细胞外液体在-5℃下保持未冷冻和过冷状态，在-5℃到-15℃的温度区间内，细胞周围的液体中会形成冰，但细胞内内容物仍然未冻结，仍处于过冷状态。由于水在过冷（细胞内）状态下的化学势比在冷冻（细胞外）状态下更高，所以水会从细胞中流出并在细胞外部冷冻，因此冷冻速率决定了冷冻效果。如果冷却速度非常高，细胞内的水不会完全流出，在细胞内冻结形成冰晶最终导致冷冻损伤。由于细胞内冰晶的形成不仅取决于冷却速度和温度，还取决于冷冻保护剂浓度，因此使用合适的冷冻保护剂可以缓解冷冻损伤。如果冷却速度很低，大部分水会流出，细胞内溶质会被浓缩，过冷会被消除，细胞处于脱水状态。细胞器和膜的体积收缩，并在达到所有溶液成分固化的温度之前暴露于高溶质浓度下，从而使脂蛋白复合物等使大分子变性，减少未冻结通道的大小，并诱导不可逆的膜融合。由此产生的高渗应力会改变电解质平衡，这可能导致细胞膨胀超过其正常等渗体积，随后在解冻时裂解。因此，高速冷冻和低速冷冻都可能导致细胞冷冻损伤，形成了冷冻损伤双因素理论：a）由于在高冷却速率下细胞内冰的致命形成，b）由于溶质/电解质浓度，细胞脱水以及在低冷却速率下细胞外空间中未冻结部分的减少。对于每种特定的畜禽类型精子都存在最佳冷却速率，并且该冷却速率被定义为低至足以避免细胞内冰的形成，但又足够高至以最大限度地减少由于溶质/电解质浓度引起的冷冻损伤。

基于上述研究，需要采取添加高效而又不对精子造成损伤的冷冻保护剂、筛选合适的冻融速度、添加抗氧化剂降低冷冻对精子的氧化损伤、冷冻前进行渗透平衡、完善冷冻稀释剂配方、采用合适的剂型、稀释液渗透压的筛选、添加表面活性剂等多种措施来尽可能降低冷冻损伤。这就要求国内冻精研究和生产企业在目前已有配方的基础上进行联合攻关，开发自主知识产权的稀释液配方，突破关键因素，从物理、化学、生物学等多角度进行冷冻损伤机制的研究。

3.3 建立标准化的猪冷冻精液的生产体系

国家标准GB／T 3951—83对标准化下的定义是：“在经济、技术、科学及管理等社会实践中，对重复性事物和概念，通过制定、发布和实施标准，达到统一，以获得最佳秩序和社会效益。”通过标准化生产流程的实施，可以达到提高质量、增强安全性、促进可持续发展等目的。猪冷冻精液生产体系规范化和标准化将会规范猪冷冻精液的生产流程，确保生产过程的安全、高效，并能生产出符合生产实际需求的质量合格的猪冷冻精液产品。

冷冻精液的生产体系涵盖精液采集、品质鉴定、平衡、去精浆、稀释、再平衡、灌装、冷冻、冻存、解冻、人工授精等多个步骤，每个步骤都对精液冷冻效果具有影响，因此需要对它们进行标准化操作，建立详细的技术参数。

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