常用消毒剂对非洲猪瘟病毒核酸的影响

1.2.2 核酸提取液制备

消毒剂与不同浓度ASFV作用产物制备：取ASFV 阳性组织样品研磨离心后取上清，用磷酸缓冲盐溶液制成10、100、1000 倍病毒稀释液，参照1.2.1 方法制备消毒剂与病毒液混合液，室温条件下(20～25℃）作用30min。

消毒剂与ASFV 不同作用时间作用产物制备：按照1.2.1方法制备得到的消毒剂与病毒液混合液，室温条件下(20～25℃）分 别作 用5、10、20、30 和40min。

消毒剂与ASFV 不同作用温度产物制备：按照1.2.1 方法制备得到的消毒剂与病毒液混合 液，分别于4℃、25℃和35℃温度条件下作用30min。

阴、阳性对照样品均按照相同条件作用处理。

1.2.3 病毒核酸提取

取200μL 上述作用后产物，按照DNA/RNA 提取试剂盒说明进行操作，提取后的核酸保存于-80℃冰箱备用。

1.2.4 数字PCR 扩增

数字PCR 反应体系：2×SuperMix 10μL，上游引 物(10μmol/L）、下游引 物(10μmol/L）各1.8μL，探 针(10μmol）0.05μL，DNA 模板2μL，用ddH2O 补齐至20μL。普 通PCR 反应条 件：95℃10min；94℃30s，60℃1min，40 个循环；4℃60min，升降温速率2℃/s。

1.2.5 检测结果分析

重复处理各组样品3 次并检测，统计平均检测值，将各组检测结果分别与对应阳性对照组比较。

2、结果

2.1 各消毒剂与不同浓度ASFV 作用结果

各消毒剂在选定稀释度下与不同浓度的ASFV 在室温条件下作用30min 后，采用微滴式数字PCR 进行检测。处理样品平行检测3 次，各组平均阳性微滴数批间变异系数为0.42%～5.91%；取同一批次样品平行提取核酸3 次进行检测，各组平均阳性微滴数批内变异系数为0.15%～2.19%。

结果显示，与阳性对照相比，本研究中不同浓度的AS-FV 与二氯异氰尿酸钠作用后核酸降解量最大，病毒核酸含量由17489.2 降为10.1，当病毒核酸含量为1743.2 时，与该消毒剂作用后检测不到病毒核酸；10 倍稀释的病毒液分别与戊二醛和过硫酸氢钾消毒剂作用后，检测的病毒核酸含量降低约100 倍，当病毒进行100 倍稀释后，这两组均未检测到病毒核酸；10 倍稀释的病毒液分别与过氧乙酸和聚维酮碘作用后，检测病毒核酸降低约0.4 倍；病毒与其他种类消毒液作用后，病毒核酸降解量相对不明显(表2）。

表2 组织样品微滴式数字PCR 检测结果

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