常用消毒剂对非洲猪瘟病毒核酸的影响

摘要：为评估不同消毒剂对非洲猪瘟病毒核酸降解能力，选择醛类(戊二醛、戊二醛癸甲溴铵）、季铵盐类(癸甲溴铵）、过氧化物类(过硫酸氢钾、过氧乙酸）、酶制剂(莱芙酶）、含氯类(月苄三甲氯铵、二氯异氰脲酸钠、次氯酸）、含碘类(聚维酮碘）等6 类9 种消毒剂，各消毒剂在选定稀释度下与不同浓度的非洲猪瘟病毒在室温条件下作用30min 后，与1.7×104copies 非洲猪瘟病毒在室温(20～25℃）下作用不同时间后和在不同温度作用30min后，采用微滴式数字PCR 进行检测病毒核酸浓度。结果表明，二氯异氰尿酸钠、戊二醛、过硫酸氢钾这3 种消毒剂相对于其他消毒剂对病毒核酸降解量最大；戊二醛与非洲猪瘟病毒作用时间不同，对病毒的核酸降解量变化最大；环境温度对过硫酸氢钾和戊二醛癸甲溴铵的非洲猪瘟病毒核酸降解能力影响最大，温度较高时，核酸降解能力增强。因此，养殖场如若消除病毒核酸污染，可选择二氯异氰尿酸钠、戊二醛、过硫酸氢钾这3 种消毒剂，且在使用过程中，戊二醛尽可能增加消毒作用时间，过硫酸氢钾适当提高消毒作用温度，来加强对病毒核酸降解能力。

非洲猪瘟 (African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒 (African swine fever virus，ASFV）引起的一种高度接触性传染病，致死率可高达100%，严重影响我国生猪产业健康发展。该病可通过多种方式传播，直接接触、间接接触及短距离的气溶胶均可在猪群传播，同时也可在在家猪-野猪-软蜱-家猪间循环传播。但目前尚无针对ASFV 的商品化疫苗，检疫、剖杀及合理的生物安全措施是防控该病的主要手段，其中生物安全措施中的消毒环节便成为养殖过程中的重中之重。

有效的消毒可直接阻断病毒的传播，是防控ASFV 传播的关键。常见的消毒方法主要包括化学消毒、物理消毒和生物消毒3 大类，这些消毒方式中化学消毒的方式使用较多。为做好ASF 防控工作，在现场消毒后，需评估消毒效果，其中最常用的方法为荧光定量PCR 方法，而当前建立的ASFV 微滴式数字PCR 方法更能直观地显示消毒剂对病毒核酸降解能力。本研究拟用微滴式数字PCR 方法检测醛类、季铵盐类、过氧化物类等6 类9 种常用消毒剂与ASFV 阳性样品作用后核酸产物的含量，评估不同消毒剂对ASFV 核酸降解能力，以期科学评价消毒剂在ASF 防控实践中的消毒效果并提供数据支撑。

1、材料与方法

1.1 材料

消毒剂：购买市面常见的醛类(戊二醛、戊二醛癸甲溴铵）、季铵盐类(癸甲溴铵）、过氧化物类(过硫酸氢钾、过氧乙酸）、酶制剂 (莱芙酶）、含氯类(月苄三甲氯铵、二氯异氰脲酸钠、次氯酸）、含碘类(聚维酮碘）等6 类消毒剂。所有消毒剂均可用于畜禽舍栏运载工具、器具消毒；皮肤和黏膜消毒。消毒剂产品详细信息见表1，所用产品均注册有兽药产品批准文号，试验时均在有效期以内。

主要试剂：磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Probe dPCR SuperMix 及微滴数字PCR 相关试剂购自北京新羿生物。

主要仪器：仪器TISSUELYSER II 组织研磨仪由Qiagen生产，微滴式数字PCR 仪由新羿生物公司生产。

组织样品：ASFV 阳性组织样品来自于中国动物卫生与流行病学中心。

1.2 方法

1.2.1 消毒剂与病毒液混合液的制备

取ASFV 阳性组织样品研磨离心后取上清液，加入磷酸缓冲盐溶液制备10 倍病毒稀释液备用。参考农业农村部文件《关于在非洲猪瘟防控中做好消毒剂选择工作的通知》 (农牧便函〔2019〕 735 号），以有效灭活ASFV 为目的，按照消毒剂说明书标明浓度范围合理选择工作浓度，制成10 倍工作浓度备用。将0.2 mL 10 倍病毒稀释液和0.2mL 消毒液加入到1.6mL 磷酸缓冲盐溶液中充分混匀。无法制成10 倍工作浓度液的消毒剂，按照1∶2 工作浓度，即将1mL 消毒剂原液和0.2mL 10 倍病毒稀释液，加入到0.8mL 磷酸缓冲盐溶液中充分混匀。阳性对照组，直接将0.2mL 10 倍病毒液加入1.6mL磷酸缓冲盐溶液中充分混匀；阴性对照组，直接取1mL 磷酸缓冲盐溶液。

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