奶牛布病免疫抗体与自然感染抗体鉴别诊断的探索

摘要：奶牛布病是重要的人畜共患病之一。国家从实施稳控到提出净化，对此给予了高度重视。在基层诊断和实施净化过程中,检测起着关键作用。临床检测中，常存在免疫后的奶牛出现临床症状，存在布病免疫抗体还是感染抗体不易区分的现象，给基层诊断和净化工作带来了困难。本文主要介绍了奶牛布病免疫抗体与自然感染抗体鉴别诊断现状，并结合临床实践筛选出虎红平板凝集试验、试管凝集试验、竞争ELISA试验、琼扩试验、荧光偏振试验等四种不同组合鉴别方法，仅供参考。

关键词：布病；试管凝集；诊断；检测试剂；奶牛　

1 布病检测及鉴别诊断现状

布病的常规血清学诊断方法以光滑型脂多糖(S-LPS)抗原为基础，包括虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、补体结合试验(CFT)等。除S-LPS分子外，光滑型布鲁氏菌表面还有一种天然半抗原(native hapten，NH)。有研究表明，接种疫苗的动物血清中检测不到NH抗体的存在，而野毒感染血清中能够检测到NH抗体的存在。目前，市场上有布鲁氏菌抗体琼扩（AGID）检测试剂盒，它是利用光滑型布鲁氏菌表面的一种天然半抗原来鉴定布病疫苗免疫和野毒感染的方法。另外，荧光偏振试验（FPA）作为新兴的布鲁氏a菌病检测方法，世界动物卫生组织（WOAH）在2016年批准了 FPA法用于牛布病的验证诊断以及羊和猪布病的检测。在我国，荧光偏振试验（FPA）也在现行的《国家布鲁氏菌病防治计划（2016—2020年）》中被列为动物布病的初筛试验。与前述的传统血清学诊断方法相比，荧光偏振试验（FPA）操作简便，能够快速给出结果，在实验室和仪器之间具有高度的可重复性。此外，传统血清学检测方法的抗原大多是布鲁氏菌细胞膜上的光滑脂多糖（S-LPS），而FPA的抗原分子使用的是光滑脂多糖（S-LPS）中最具有免疫原性优势的O-多糖（OPS），这使得FPA法能够区分免疫动物和自然感染动物，疫苗免疫后动物体内OPS抗体水平非常低，而自然感染动物体内抗体水平高。有报道显示，FPA的敏感性和特异性均很高，能达到90.02%和99.96%。鉴于上述报道，笔者结合实际工作，对奶牛布病自然感染抗体和疫苗免疫抗体鉴别诊断进行了探索，总结出以下四种方案。

2 鉴别诊断方案的确立试验

2.1 鉴别诊断筛选方案（一）

1）试验对象 采集未免疫布病或免疫期超过18个月的奶牛血清12,567份。

2）试验方法 ①虎红平板凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.4操作；②试管凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.6操作；③竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.9操作。

3）试验结果 虎红平板凝集试验初筛79份阳性，试管凝集试验或竞争ELISA试验复核出阳性20份，结果见表1。

4）结论与分析 由结果可见虎红平板凝集试验的假阳性率还是很高的。未免疫机体或免疫超过18个月（疫苗抗体已经降低到检测程度以下），通过虎红平板凝集试验初筛，试管凝集试验或竞争ELISA试验复核阳性者可视为野毒感染牛。

2.2 鉴别诊断筛选方案（二）

1）试验对象 采集免疫18个月内的无症状牛群血清5,179份。

2）试验方法 ①虎红平板凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.4操作；②试管凝集试验参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.6操作；③竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）参照GB/T 18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术中4.9操作；④布鲁氏菌抗体琼扩（AGID）试验参照试剂盒（青岛瑞尔唯特生物技术有限公司）说明书操作。操作步骤：将15μL阳性对照和15μL阴性对照加入琼脂板侧面的2个孔中。在琼脂板侧面剩下的孔中加入15μL待测血清。将15μL抗原加入到中央孔中。将接种好的琼脂板在培养箱中室温孵育24～48h；结果读取及解释：在24h和48h后读取结果，使用斜射光源。没有沉淀线意味着动物没有被感染。

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