口蹄疫免疫抗体检测经典方法详述

5、血清的稀释、加样、转移、洗涤及拍板

（1）血清的稀释：稀释待检血清时先加稀释液，然后加待检样品。

（2）加样：加样时要将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，同时轻轻晃动均匀，不能出现气泡，否则一些弱阳性的样品容易出现假阴性；加样不宜太快，不可溅出；每次加样都要保持同样的顺序，板数多者要单独计时，保证每板反应时间充足。

（3）移板：将抗原抗体混合液从反应板转移至ELISA板上，目的是将反应板中的抗原抗体复合物和没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原转移到包被了口蹄疫O型或A型特异性抗体的ELISA板中，继续进行后续的免疫反应及酶促反应。转移时，按顺序转移，避免出错，同时及时更换枪头。

（4）洗涤：洗涤是 ELISA 操作中的关键技术之一，每孔加入洗涤液300ul，洗涤 3~ 5次，同时每次洗涤的时间一般为 30 s。洗板时需保证酶标板平放，将洗涤液注满各孔，避免漏液、溢液现象。

（5）拍板：拍板时避免手指接触板底，同时应注意观察板孔内有无气泡附着， 如有气泡，则需在加样前一一去除。

6、试验显色、终止、读数

（1）显色：显色是 ELISA 操作中的最后一个反应步骤，是酶催化无色底物，生成有色产物的过程。反应温度和时间是影响显色的因素。因此，加入底物后的反应温度应严格按实验操作说明书执行。根据底物显色情况，反应时间可适当调整为10～15 min。

（2）试验终止：终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应结束后应尽快加入终止液。

（3）OD 值读数：读数前应先将酶标仪预热半小时，读数时应注意微孔板底部洁净无污染，如有水分应仔细擦干，同时定期清洗酶标仪滤光片。

四、不同口蹄疫抗体检测试剂盒结果差异分析    

目前除了液相阻断ELISA试剂盒外，市场在售口蹄疫抗体检测试剂盒种类较多，其他大部分试剂盒仅包被结构蛋白VP1的部分片段；若仅包被VP1，导致毒株特异性强，而同一血清型不同谱系毒株VP1序列差异大，所以检测结果常常出现偏颇。而液相阻断ELISA抗体检测试剂盒包被全病毒抗原，对同一血清型不同谱系毒株差异小，检测结果更客观、准确。

六、总结   

口蹄疫灭活疫苗属于生物制品，当疫苗注入机体后会发生复杂的反应，所以口蹄疫疫苗质量评价必须要科学全面，才能综合判断疫苗的免疫效力。抗体检测是目前评价口蹄疫疫苗免疫效果的重要方法之一。因此，首先要选择科学的检测方法和性质优良的试剂盒来评价免疫抗体水平；实验时，要仔细阅读说明书，严格按实验步骤操作；同时要对每个环节进行优化，提高实验结果的精确性，保证实验结果的真实性和客观性。    

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