猪圆环病毒2型检测技术研究进展

猪圆环病毒（PCV）是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒1型（PCV1）和有致病性的猪圆环病毒2型（PCV2），猪圆环病毒3型（PCV3），猪圆环病毒4型（PCV4）。PCV2主要侵害机体的免疫系统，引起机体继发感染断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道病综合征（PRDC）、母猪繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、仔猪先天性震颤等疾病。PCV2现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病病原，因此建立即时有效的检测PCV2的技术方法尤为重要，文章综述了多种PCV2检测技术，旨在为养殖场PCV2有关疾病的检测防控提供技术支持。

1、病毒分离培养

PCV2可选用猪肾细胞、PK-15细胞、猪睾丸细胞等来进行分离培养，取病死猪的淋巴结组织研磨，加PBS缓冲液制成悬液，-20℃反复冻融3次后离心取上清液，经过滤器过滤除菌，接种易感细胞，置于37℃培养箱，盲传1~3代后进行PCV2抗原或核酸检测加以鉴定。

病毒分离培养可以观察到病毒接种细胞后产生的细胞病变，但此方法首先需要培养出状态较好的病毒易感细胞，这个过程比较耗时，操作过程中容易遭到污染，且血清成本高，因此不适用于常规检测。

2、电镜观察

电子显微镜是用电子束代替可见光的显微装置，一种高放大，高分辨的大型精密仪器。电镜检测技术主要有扫描电镜和透射电镜，扫描电镜主要通过发射电子聚焦光束来扫描PCV2样品的表面形态确定病毒，透射电镜则是通过电子束穿透组织和细胞来观察PCV2感染细胞内的超微结构来检测病毒。电镜法具有直观，快捷等优点，但是电子显微镜设备价格较高，且该法只能观察病毒的外观形态，很难与同科的病毒相区别。

3、聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA半保留复制原理，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计特异性引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP，从而完成特定基因的体外复制。这是一种快速，灵敏，特异性强，对样本纯度要求较低的病原学检测方法。在普通PCR的基础上，发展出了多种形式的PCR技术，包括实时荧光定量PCR、多重PCR、数字微滴PCR、其他PCR等。

4、环介导等温扩增法

环介导等温扩增法（LAMP）是2000年时开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在恒温条件保温30~60min，即可完成核酸扩增反应。此法的灵敏度高，特异性强，且不需要电泳，可以进行室外检测，但反应需要的仪器价格昂贵，检测成本较高。

5、重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增（RPA）技术使用重组酶与引物结合形成的复合物能在模板上寻找同源序列，定位后就会引发链交换反应并启动DNA合成对模板上的目标区域进行指数式扩增。实时RPA测定为快速，简单和可靠地检测PCV2提供了一种替代工具，特别是在没有专业设备仪器的偏远农村地区。

6、重组酶辅助扩增

重组酶辅助扩增（RAA）是一种等温核酸扩增技术，可以在恒温下快速扩增靶基因片段，使用带有相应抗体的试纸可以目视检测标记有特定分子的扩增产物。具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作方法简单等优点，所以PCV2RAA试纸适用于PCV2现场的快速临床检测。

7、原位杂交法

原位杂交法（ISH）是指用特定标记的已知序列核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的过程。HansenMS等用原位杂交法（ISH）检测PCV2的核酸，在受PMWS影响的猪中，20头猪胸腺样本中有19份检测结果为阳性，阳性率为95%。BaróJ等在96头患有肠道疾病并提交尸检的猪中，72头猪通过原位杂交（ISH）显示PCV2呈阳性，阳性率为75%。

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