qPCR常见问题及解决方案（图）

②有Ct值且＜35，表示反应体系被污染，可逐步排除污染源。

2）NRC有扩增

NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒（如Cat NO.11141ES）。

【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应；NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。

9.复孔重复性差

1）加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。

2）模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。

3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

二、熔解曲线异常

熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，异常的熔解曲线可能会出现双峰、杂乱等情况，下面我们来逐一分析。

1.熔解曲线出现双峰

1）双峰，杂峰Tm在80℃之前

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