CRISPR技术在山羊和绵羊育种的研究进展

2 CRISPR/Cas9 技术在羊育种研究中的应用

CRISPR/Cas系统自发现以来，在基因治疗、制作抗体药物、构建模式动物等方面得到广泛应用，同时在提升羊的生产性能方面也展开了大量研究，为羊的精准育种提供基础。

2.1 CRISPR/Cas9 技术在提升羊肉品质研究中的应用

已有研究表明肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是一类能够对骨骼肌的生长起负调控作用的基因，抑制哺乳动物中的MSTN基因可有效促进骨骼肌的生长分化，引起双肌表型。

2014年，有研究将CRISPR/Cas9系统应用于编辑MSTN、BLG、PrP和NUP155共4个羊成纤维细胞基因，并利用体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transplantation，SCNT）方法成功产生了3 只MSTN基因敲除山羊。2015年，Crispo等利用CRISPR/Cas9技术和受精卵显微注射技术高效生产了MSTN基因敲除绵羊，新生22只羔羊中有10只羊的MSTN基因突变，并表现出双肌表型和体重显著增加的现象。这些研究为进一步在小反刍动物上应用CRISPR/Cas9技术提供了有效参考。2016 年，Wang等通过注射单个sgRNA至单个细胞阶段的羊胚胎中，精确靶向敲除了MSTN、β-caroteneoxygenase 2（BCO2）和agouti-signaling protein（ASIP）基因， 且未检测到脱靶效应， 证明了CRISPR/Cas9介导基因组编辑的多重性，以及改善绵羊不同基因决定不同性状的可能性。直至2019年，Zhang等利用CRISPR/Cas9 技术研究了乙酰CoA酰基转移酶2（ACCAA2）在绵羊前体脂肪细胞分化过程中的重要作用，为阐述羊肉品质的形成机制奠定基础。2020 年，Ding等利用CRISPR/Cas9技术精确删除了滩羊的MSTN 基因的长基因组片段，得到的MSTN 敲除羊体重较野生型羊显著增加，这为接下来动物模型的构建和基因大片段的删除或插入的功能研究提供了重要参考。同时，他们还发现了双sgRNA定向CRISPR/Cas9系统可以高效敲除哺乳动物基因组。

2.2 CRISPR/Cas9 技术在改良羊毛品质研究中的应用

羊毛纤维长度和平均纤维直径是绵羊的重要经济性状，它与羊毛的产量和质量密切相关。

成纤维细胞生长因子FGFs家族成员FGF5基因被证明在毛发生长过程中对毛发生长期有抑制作用，突变FGF5基因可以促进毛发生长并延长毛囊的生长期，进而改善羊毛品质。Wang等利用CRISPR/Cas9系统将MSTN和FGF5基因的Cas9 mRNA 和sgRNA显微注射至山羊胚胎中，成功获得MSTN和FGF5双基因修饰的山羊，所得羊只的羊绒产量和生长速度均显著提高。Li等利用CRISPR/Cas9 系统编辑中国美利奴细毛羊的FGF5基因，获得了16只目标位点突变的细毛羊，12只1岁基因编辑羊的毛丛自然长度和拉伸长度均显著长于野生型对照。Zhang等通过CRISPR/Cas9干扰ASIP基因的表达，出生的6只美利奴羔羊中有5只羊的ASIP基因位点缺失，羔羊表现出多种毛色图案，进一步研究发现，修饰发生在1个或2 个以上的ASIP基因拷贝中，在靶向修饰位点前第2外显子的9 bp和5 bp缺失的额外自发突变可能涉及被毛颜色的形成。Hao等设计了2 个相反的sgRNA 在绒山羊中成功定位了外膜异常酶受体（EDAR）基因，并与编码Cas9的质粒共转染羊成纤维细胞，测序结果显示变异率达69.7%。胸腺素β 4（Tβ 4）是一个小分子蛋白，包含43个氨基酸残基，可用于激活毛囊干细胞的迁移和分化。Li等利用CRISPR/Cas9 系统并结合SCNT技术，以肌源性卫星细胞作为核供体获得了绒山羊Tβ4基因在CCR5（趋化因子受体5）上的作用轨迹，敲入Tβ4 基因的山羊产绒量增加74.5%。

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