我国鼻气管鸟杆菌流行现状及分析

摘要：通过对2020年山东、河北、河南等16省份送检的266份家禽病料进行细菌分离鉴定、PCR检测等手段，确诊出52株鼻气管鸟杆菌，平均检出率为19.5%。对确诊病例进行流行病学分析，结果显示，该病在全国发病范围较广；一年四季均可发病，各生长阶段均可发病，且随着日龄增长鸡群发病呈增多趋势；单纯感染较少，多为两种或两种以上疾病混合感染；通过对该病流行病学分析，可为有效预防和控制该病提供参考。

鼻气管鸟杆菌病(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)是由鼻气管鸟杆菌引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，主要感染鸡和火鸡。临床表现主要是呼吸道症状、生长障碍、死亡率增加，病理变化主要是脸部肿胀、纤维素性化脓性肺炎和气囊炎。继发或合并感染比较普遍，常与禽流感病毒、大肠杆菌、传染性鼻炎、传染性喉气管炎病毒等病原混合感染，导致感染鸡群生长缓慢、死亡率增大，给养禽业造成巨大的经济损失。该病1981年由德国学者发现，1994年比利时学者才建议使用鼻气管鸟杆菌这个词语，之后在美国、德国、英国、法国、以色列、荷兰、南非等许多国家发生。我国陈小玲等[2]在2000年首次分离到鼻气管鸟杆菌。泰国、伊朗、台湾等国家进行该病流行病学和血清型调查，发现ORT阳性率很高，预示该病呈蔓延趋势。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

来自山东、河北、河南等16省份的266份送检表现肿脸、呼吸道症状的病死鸡的病料。

1.1.2 试验动物

35日龄SPF，购自济南斯帕法斯家禽有限公司。

1.1.3 试验材料

药敏片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；微量生化反应小管，购自北京陆桥技术有限公司；营养琼脂、麦康凯琼脂，TSA培养基、BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司；DL2000 DNA Marker购自上海宝生物工程有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 试验设备

生物安全柜，苏净安泰BSC-1600IIA2；显微镜，奥林巴斯CX-31；全自动样品快速研磨仪，上海净信科技Tiss-24；基因扩增仪，杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b)c；恒温培养箱，三洋MCO-15AC。

1.2 方法

1.2.1 临床症状与病理变化

观察记录发病鸡群临床症状及解剖病理变化，总结流行特点、临床症状及病理变化。

1.2.2 细菌分离与培养

无菌采集病料的气囊、肺脏、心血，用接种环取病料组织接种于营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板和含5%新生牛血清的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基(TSA)平板上，置37℃、含5%CO2培养箱中培养24～48 h，观察结果并对分离的细菌进行染色镜检。

1.2.3 生化试验

通过培养镜检对疑似ORT菌进行生化试验，按常规方法进行氧化酶、过氧化氢酶试验、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、尿素酶、乳糖、蔗糖、麦芽糖和果糖发酵。

1.2.4细菌PCR鉴定

取ORT菌落接种含2%新生牛血清的BHI培养基37℃温箱中培养36 h，取1 m L放入1.5 m L无菌的离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃掉上清，加入无菌水中将菌体重悬，使用振荡器震荡摇匀，沸水浴7 min，再冰浴5min,12 000 r/min离心1 min，上清液作为基因扩增的模板，-20℃保存备用。根据Gen Bank已发表的ORT 16S r RNA基因序列，上游引物ORT1F:5’ATAGCCCGGGGAAACTCGGATT 3’,下游引物ORT1R:5’GGCATCGTTTACTGCGTGGACT3’，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，用灭菌的双蒸水稀释为25μmol/L,-20℃保存备用，预期扩增的片段长度为500 bp。PCR反应体系为25μL:dd H2O 16.1 m L,10×PCR buffer 2.5μL,Mg2+1.0μL,d NTP 2.0μL,上下游引物0.8μL,DNA模板2.0μL,r Taq DNA polym erase0.3μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min;94℃50 s;56℃50 s;72℃1 min,30个循环后；72℃延伸10 min。取PCR产物5μL用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

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