褪黑素在牛体外胚胎生产中的应用研究进展

精子的存活率、活力和膜完整性会在冷冻过程中下降，冷冻-解冻过程中的冷休克还可能破坏线粒体以及精子的质膜和顶体膜。Ashrafi等研究发现在精液稀释液中添加褪黑素可以抵消冷冻解冻过程对公牛精子活力、存活率、形态正常和质膜完整性的不利影响。Pang等研究发现褪黑素处理牛精子后，精子与体外培养胚胎受精后胚胎发育到囊胚的比率显著提高，囊胚的凋亡率显著降低；褪黑素处理的精子产生的胚胎中CASP3 和BAX丰度显著降低，而BCL、XIAP和CAT转录丰度显著升高。Perumal等在牛体内埋植褪黑素后采集精液体外冷冻解冻，发现精液的运动参数、线粒体膜电位、抗氧化特性、核畸形比率、细胞内酶流失以及精子体外透明带结合能力指数均有显著改善。

玻璃化冷冻会降低哺乳动物卵母细胞的发育潜力和胚胎的着床能力，这主要是由于玻璃化冷冻导致卵母细胞中ROS活性和凋亡水平异常升高所致。褪黑素可以有效改善此类情况，提高体外卵母细胞和胚胎的冷冻效率。Zhao等研究发现在体外成熟液和玻璃化冷冻液中加入褪黑素可降低玻璃化卵母细胞的ROS、线粒体钙离子、Bax mRNA表达和Caspase3蛋白水平，降低磷脂酰丝氨酸外部化和DNA碎片率，提高线粒体膜电位和Bcl2 mRNA的表达水平，从而提高玻璃化冷冻卵母细胞孤雌激活后的发育能力。

在褪黑素对牛胚胎冷冻保存方面，Wang等研究发现，褪黑素可显著提高解冻后24~72 h的囊胚孵化率，显著降低解冻后48~72 h的死亡率；胚胎培养过程中加入褪黑素，解冻后DNMT3A、OCC、CDH1 基因表达显著增加，AQP3基因表达显著降低，提高牛胚胎的冷冻耐受性，从而提高牛胚胎质量。Marques 等[38]研究培养液中添加褪黑素和玻璃化冷冻前去除囊胚液体对牛体外胚胎质量和存活率的影响，发现在冷冻保存前添加褪黑素可提高胚胎的孵化率，提高编码热休克蛋白基因HSPA5的表达；此外，在培养液中添加褪黑素对玻璃化冷冻囊胚的形态质量、存活率、升温后胚胎耐受性以及胚胎存活率都有着积极的作用。综上研究都表明褪黑素不但对牛配子和胚胎体外正常条件下有着保护和促进作用，而且对牛配子和胚胎冷冻保也存有积极影响。

5 展望

随着各种新的辅助生殖技术在牛场中的应用，牛体外胚胎生产对牛场的生产经营和发展变得愈发重要。在体外胚胎生产过程中的氧化应激是限制其发展的主要因素之一，近些年褪黑素被认为是一种重要的自由基清除剂，它的抗氧化性得到充分关注。目前已有多项研究表明，褪黑素在牛体外胚胎生产过程中有着积极的作用，然而褪黑素在体外培养不同条件下的添加方式和浓度还需要进一步研究，以及褪黑素在这些过程中的具体作用机制还需要深入探索。

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