几种布鲁氏菌病检测方法比对结果分析

1.2　试剂

布病虎红平板凝集和试管凝集试验抗原，购自青岛立见生物科技有限公司；A19 株疫苗，为新疆天康畜牧生物有限公司生产的活毒疫苗；布病iELISA 试剂盒（批号 20191008），购自爱德仕公司；cELISA 试剂盒（批号 20191022）、布病抗体琼扩法检测试剂盒（批号 20190812），购自西班牙 INGENASA 公司；间接法布病抗体胶体金试纸条，购自青岛瑞尔唯特生物技术有限公司；荧光定量 PCR 引物和探针，购自上海生工生物工程有限公司。

1.3　国家标准方法

虎红平板凝集试验、试管凝集试验、cELISA、iELISA，均按照国标（GB 18646—2018）操作。

1.4 琼脂扩散试验

抗体琼脂扩散（琼扩）试验基于布鲁氏菌野毒株和疫苗株的表面抗原差异，可区分被检动物是否存在野毒感染。血清中抗体与相应抗原在琼脂胶中扩散，相遇后会结合形成沉淀线。试剂中的抗原包含一种布鲁氏菌中普遍存在的脂多糖（LPS）和一种野毒株表面的多糖类半抗原（NH）。检测时，在琼脂胶中央孔里加入抗原，在周边孔中加入阴阳性对照和血清样品，室温静置 24~48 h。若无沉淀线且对照成立，则认为动物无感染或免疫；若只出现 LPS 的沉淀线，则被检动物很可能仅免疫未感染；若出现两条沉淀线，则认为被检动物存在野毒感染。

1.5　胶体金试纸条检测法

吸取 5 µL 血清样品滴入间接法胶体金试纸条加样孔中，10~20 min 观察结果。当对照线和检测线同时出现，则认为样品为阳性。另用相同试纸条检测牛奶样品，方法同上。

1.6　病原学检测

1.6.1 引物　采用荧光定量 PCR（qPCR，探针法）对牛奶中布鲁氏菌进行检测。首先建立布鲁氏菌属（BSSP）和牛种布鲁氏菌（BA）的标准曲线。BSSP 作为通用引物，可检测所有种的布鲁氏菌，起到双重检测目的，从而保证阳性结果的准确性。引物信息详见表 2。

表2 qPCR 引物

1.6.2　奶样处理　吸取 10 mL 采集的奶液加入 3%柠檬酸钠 - 磷酸缓冲液，振荡混匀，3 000 r/min 离心 30 min；用移液器将表层脂类及上清弃去，留下沉淀；加入 PBS 缓冲液（pH7.6），振荡混匀，转移至 1.5 mL 离心管中，12 000 r/min 离心 10 min，弃上清，将沉淀保留下来；按照试剂盒说明书操作提取核酸，反应条件为 95 ℃变性 30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火 30 s，40 个循环。

2　结果与分析

多份样品在不同检测方法中显示出不同的阳性判定，结果见表3。

表3　血清及牛奶样品检测结果

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