动物源性食品中有害化学物质及污染物的检测——孔雀石绿

另取50mL离心管加入10mL乙腈，洗涤匀浆机刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，加入3mL硼氢化钾溶液，用玻棒捣散离心管中的沉淀并搅匀，涡旋混匀器上振荡1min，静置20min，4 000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中。

在50mL离心管中继续加入15mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸铵缓冲溶液，振荡2min，再加入10mL乙腈，继续振荡2min，4 000r/min离心10min，上清液并入125mL分液漏斗中，重复上述操作1次。

在分液漏斗中加入20mL二氯甲烷，具塞，剧烈振摇2min，静置分层，将下层溶液转移至250mL茄形瓶中，继续在分液漏斗中加入5mL乙腈、10mL二氯甲烷，振摇2min，把全部溶液转移至50mL离心管，4 000r/min离心10min，下层溶液合并至250mL茄形瓶，45℃旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。

净化：将PRS柱安装在SPE装置上，上端连接酸性氧化铝SPE柱，用5mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用乙腈洗茄形瓶2次，每次2.5mL，依次过柱，弃去酸性氧化铝柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情况下，加入3mL等体积混合的乙腈和乙酸铵溶液，收集洗脱液，乙腈定容至3mL，过0.45μm滤膜后上机测定。

刘少彬等在实际检测中发现，GB/T 20361—2006中的高效液相色谱荧光检测器法存在回收率差异大、分层有时不明显，基线噪声不稳定等缺陷，针对这些问题提出了一些改进的建议。

如前所述，GB/T 20361—2006方法中是先加入10mL乙腈，提取后加入酸性氧化铝振荡离心，上清液移入分液漏斗中，在分液漏斗中加入硼氢化钾振荡。实际检测中发现，在第一步乙腈提取液中加入硼氢化钾，静置还原后接着加入酸性氧化铝，既可有效地使孔雀石绿得到充分还原，而且又可以有效地去除大分子脂肪和促进层析。这就减少了加乙腈提取后在分液漏斗中加硼氢化钾振荡还原这一步，既缩短了检测时间又减少了乙腈的试剂用量，依然保证了较高回收率。

GB/T 20361—2006中是直接加入20mL二氯甲烷来进行萃取，但分层缓慢，且会出现有几层有时忽上忽下的现象，如果样品油脂含量较高，容易出现乳化现象。若在分液漏斗中先加入10mL水，加入少量氯化钠，改进方法的回收率及精确度试验分层明显。原因是加入水可洗去萃取液中水溶性杂质，利于分层，而少量氯化钠可防止大面积乳化现象发生。

净化过程中，在移除酸性氧化铝柱后，建议比GB/T20361—2006多加一步骤，用3mL水淋洗PRS柱。结果表明，加水淋洗PRS柱可有效去除停留在PRS上的水溶性杂质而又不影响待测物孔雀石绿，有效降低基线噪声，大大提高回收率。

杨贤庆等在实际检测中发现，GB/T 20361—2006中，在鱼肉前处理过程，为了将孔雀石绿完全还原，多次加入硼氢化钾，使试验操作繁琐复杂。为了确定硼氢化钾的还原效果，杨贤庆等通过试验，得出2.4μg孔雀石绿被完全还原仅需要硼氢化钾15μg，由此说明硼氢化钾的还原效果非常好，但硼氢化钾在酸性条件下反应产生氢气，所以在乙酸铵缓冲液体系下，还原效果很差。另外，如果硼氢化钾在对甲苯磺酸之后加入，硼氢化钾也会与对甲苯磺酸发生反应，因为对甲苯磺酸呈弱酸性。故采取在浓缩后加入0.1mL的硼氢化钾还原，而避免在前处理酸性环境下加入，影响其还原效果，从而避免了前处理过程中多次加入的繁琐。

6.3.3水中孔雀石绿的样品处理方法

刘桂花等建立了水中孔雀石绿和无色孔雀石绿的同位素内标稀释LC-MS/MS，方法简单，主要利用离子交换柱高度富集浓缩水中待测物，水样中加入氘代同位素内标，经SCX柱提取和净化。

样品处理：量取100mL鱼池水样加入50μL浓度为100ng/mL的混合内标，转移至先用5mL乙酸-乙腈（5∶95，V/V）溶液活化过的AgilentSCXSPE小柱上，以流速1~3mL/min过柱。待水样全部过完柱后依次用25mL丙酮、5mL甲醇和5mL乙腈淋洗。用10mL氨水-乙腈（5∶95，V/V）溶液洗脱小柱，收集洗脱液在40℃下用氮气吹至0.5mL，加入0.5mL 2mmol/L乙酸铵溶液，涡旋混匀15s，过0.45μm有机系微孔滤膜备用。

7、检测方法

根据目前各类检测方法的不同检测原理，分为化学分析法和免疫化学法两大类。

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