动物源性食品中寄生虫的检测——新孢子虫

免疫刺激复合物ELISA：将新孢子虫的粗提抗原与免疫刺激复合物（皂苷、胆固醇、磷脂相）结合作为包被抗原，检测新孢子虫病，并且与弓形虫或其他亲缘关系较近的原虫没有交叉反应。Bjorkman等用该方法对240头流产的荷斯坦牛的血清进行检测，结果显示有190头牛检测为阳性，阳性率为79%。与IFAT比较，该方法具有96%的特异性，并且同其他相近的寄生虫没有交叉反应。

4.2.3 间接荧光抗体试验（IFAT）

将完整速殖子固定在载破片上，与待检血清共孵育，然后与荧光素标记的二抗相作用，在荧光显微镜下观察。可用于测定血清和初乳中新孢子虫IgG抗体效价，具有高度的敏感性、特异性和重复性。Conrad等于1993年首次应用IFAT对牛血清进行新孢子虫抗体检测。延边大学鲁承等对从吉林省21个县、市牛群中采取的1091份牛血清进行了间接荧光抗体检测，其新孢子虫血清抗体阳性率为17.32%。

4.3 分子生物学诊断

应用较多的主要是PCR，可从流产胎牛的组织内检测到新孢子虫DNA，但也能从牛乳中检测到新孢子虫DNA。

4.3.1 PCR

NcSRS2和Nc-5基因是新孢子虫的重要功能基因，与弓形虫的同位基因的同源性很低。Hempill等设计了一对特异性引物，扩增NcSRS2基因，并进行序列比较，可以确诊新孢子虫的存在与否。Muller等用特异性引物Np6/Np21扩增Nc-5基因，建立PCR，能检测到1mg组织中的1～10个速殖子。岳韬等利用PCR对流产奶牛血样进行检测，其敏感性试验显示，最低能检出DNA量为2.5pg。应用于PCR的其他靶基因有18S rDNA、28S rDNA基因等。

4.3.2 巢式PCR

Lally等利用一对特异性NS1和TS3引物建立巢式PCR扩增rDNA的ITS1，可以证明新孢子虫的存在，该方法能够检测到25个速殖子，相当于2pg基因组DNA；Medina建立巢式PCR，能检测到0.01～0.1个速殖子的基因组，灵敏度是目前建立的新孢子虫PCR检测方法中最高的。

4.3.3 单管套式PCR

Ellis等设计合成内外两对引物，建立单管套式PCR，第一轮反应中用通用引物先扩增出18S rDNA，第二轮再用特异性引物扩增新孢子虫18S rDNA。这种PCR诊断法对于靶序列的特异性复制产物特别敏感，可从分离于自然感染的牛的经福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中扩增新孢子虫DNA，达到临床诊断的目的。

4.3.4 定量PCR

定量PCR用于检测的目的基因是Nc-5基因，此方法能进行新孢子虫DNA定性和定量检测，成为研究新孢子虫病发病机理的重要方法。在定量PCR的基础上，发展应用特异性荧光探针的实时定量PCR。

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