时间：2021-07-12 点击： 次 来源：中国兽医发布 作者：曲志娜，赵思俊等 - 小 + 大
| 5.1.4 生化鉴定 挑取营养琼脂斜面菌落分别接种于三糖铁琼脂、蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、氰化钾肉汤，并置（36±1）℃温箱中培养过夜。 三糖铁底层产酸，硫化氢阴性，氰化钾阴性和尿素阴性的培养物为大肠杆菌。 5.1.5 血清学分型 挑取经生化试验证实为大肠杆菌的菌落，用大肠杆菌多价O血清和肠出血性大肠杆菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做凝集试验。 5.2 生化鉴定试剂盒方法 API20E试验条由20个含干燥底物的小管所组成。这些测定管用细菌悬浮液接种。培养一定时间后，通过代谢作用产生颜色的变化，或是加入试剂后变色而观察其结果。 挑取营养琼脂斜面上单个纯菌落于灭菌纯水中，制成菌悬液。按照生化鉴定试剂盒操作说明，将菌悬液加入20E反应条的各反应孔内，放入反应槽中，置37℃温箱中培养24h。取出后根据说明书观察反应结果，在软件上记录结果，系统将自动出现检测结果。所得反应的类型必须以数字化形式记录在报告单中，每3个测定为一组，每个以1、2和4标明，在每组中，阳性反应以相应的数字相加，由API20E的20个测定可得一个7位数。 5.3 分子生物学方法 从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用无菌去离子水制成菌悬液，水浴煮沸10分钟，3000r/min离心，以上清液为模板，进行扩增。上游引物为5′-TGT TCA GTG GCA AGA GTT-3′，下游引物为5′-TAA TCG ATA TAC CCG CTC-3′；扩增体系：10×buffer5μL，Taq DNA聚合酶（2U/μL）1μL，氯化镁溶液（25mmol/L）5μL，dNTP（2.5mmol/L）5μL，双蒸水（ddH2O）29μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，模板1μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共作用36个循环。PCR产物用15%的琼脂糖在100V条件下进行电泳，得到扩增长度为353bp的扩增产物，可鉴定该菌为大肠杆菌。 5.4 VIDAS鉴定肠出血性大肠杆菌O157方法 VIDAS鉴定肠出血性大肠杆菌O157（ECO）方法是一种在自动VIDAS仪器上进行的酶联荧光免疫分析的方法。其原理是：煮沸过的增菌肉汤加入试剂条孔后，在特定时间内，样品在固相容器（用抗肠出血性大肠杆菌O157抗体包被一个类似于加样头的一次性使用装置）内、外反复循环。样品中的O157抗原与包被在固相容器内部的O157抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体也在固相容器内、外循环并与固定在固相容器壁上的肠出血性大肠杆菌O157抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。仍结合在固相容器壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物4-甲基伞形酮，在VIDAS中由光扫描器在450nm处检测其荧光强度，试验完成后由计算机自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样品的试验报告。其检测步骤如下： 挑取肠出血性大肠杆菌O157可疑菌落，放入1mL无菌纯水中制成菌悬液，或直接取1mL培育24h的增菌液，置水浴锅中95～100℃煮沸15min后，冷却至室温，同时设质控对照并煮沸、冷却，以备检测。 （1）将所需试剂取出，使其恢复至室温（至少30分钟）。 （2）每个样品使用一条ECO试剂条及一个ECO固相容器，先必须做好质控和校正。确保取出试剂后，将装有剩余固相容器的袋子重新密封好。 （3）输入所需的信息以便建立工作列表（work list），键入“ECO”至检测编号，再输入将要检测的试验号。标准（S1）必须在work list的首位并做双份，随后是质控（C1和C2）。 （4）使用前彻底混匀标准、质控及灭活的样品。准确吸取500μL以确保测试的正确性。 （5）吸取500μL的质控及灭活的样品至ECO试剂条样品孔的中央。 （6）依屏幕所示，将固相容器和试剂条放入仪器的相应位置。核对位置，以确保固相容器上3个字母编码的颜色标记与试剂条相符。 （7）检测结束后，仪器自动打印检测结果。
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