非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

ASFV能够持续存在于自然宿主和感染后康复的家猪体内，呈现较低毒力，表明该病毒具有有效机制来逃避宿主防御系统。因此，在缺少有效疫苗的条件下，只能通过扑杀的方式来控制ASF的蔓延，因此早发现早处理显得尤为重要。能用于ASFV抗体检测的抗原蛋白可有多种，其中P30、P72和P54结构蛋白具有较好的诊断意义。ASFV P72结构蛋白是病毒衣壳的主要成分，也是目前研究最多的诊断靶标。Tabares等就以P72蛋白作为包被抗原成功建立了抗体检测试剂盒。该蛋白在病毒感染晚期表达，免疫原性好、保守性强。ASFV P54蛋白具有很强的免疫原性，是Western-blot诊断疫病时最令人关注的病毒蛋白之一。ASFV P54主要含有线性表位，而P30主要含有构象表位。因此，这些蛋白表位结构的差异可以解释ELISA和Western-blot中发现的P30和P54反应性的不同。相比于P72和P54蛋白，建立ASFV P30 iELISA检测方法可以早期检测和处理感染。

本研究在ASFV P30-2His6的基础上，利用基因工程原理设计引物去除His标签，构建了以pET-28a（+）为表达载体的ASFV P30蛋白表达工程菌。相比较于用酶切蛋白去除His标签，本研究建立的方法在去除His标签的同时不影响蛋白的其他性状，使ASFV P30蛋白的表达量高，水溶性好，因而有利于规模化生产。与吴竞等利用pET-32a（+）载体成功表达带有His标签的包涵体ASFV P30蛋白建立的iELISA检测方法相比，本研究表达的P30蛋白是水溶性的无标签蛋白，在临床应用上更有优势，可以消除带组氨酸标签的基因工程疫苗免疫猪造成的假阳性。去掉His标签后不能用亲和层析的方法来纯化，只能选择凝胶过滤层析和阴离子交换柱等方法进行纯化，因此纯化难度相对较高。本研究将纯化后的蛋白经过SDS-PAGE分析和灰度扫描，发现纯化后的重组ASFV P30蛋白纯度为95%，而用镍柱纯化的重组ASFV P30-2His6纯度为98%，可见镍柱的纯化效率更高。但是iELISA检测结果明确表明，尽管ASFV P30纯度稍低，然而不仅没有影响检测的准确率，而且由于去除了His标签，消除了假阳性检测结果，极大提高了检测的准确性和可靠性。在对40份背景清晰的阴性血清检测过程中，用ASFV P30-2His6为包被抗原的iELISA检测时，有27份血清检测结果为弱阳性或可疑，只有13份为阴性，而用ASFV P30为包被抗原的iELISA检测时，40份血清均为阴性。进一步比对分析这40份阴性血清来源，发现这27份检测结果为弱阳性或可疑的血清，均来自至少免疫过带His标签亚单位疫苗2次的猪场，13份检测结果为阴性的血清，均来自没有免疫过带His标签亚单位疫苗的猪场。

对于该检测方法的阳性临界值确定，单纯以OD450值作为判断依据无法完全避免批次间或批次内不同时间段检测对试验结果的影响。阴性血清用不同批次的试剂盒或用同一批次试剂盒在不同时间段检测的数据都有小幅波动，其变异系数（CV）为5%~10%。引入一个标准阳性（S/P，样本OD450/标准阳性OD450）或标准阴性（S/N，样品OD450/阴性OD450），可以最大限度消除这种差异对结果判断的影响。而S/N值的可靠性和稳定性更好。

国际上公认ELISA S/N≥2.1为抗体阳性判断标准。而P30蛋白检测ASFV抗体的灵敏性非常高，为了降低假阳性出现的概率而将S/N的阈值定为2.5，当待检血清样品的S/N≥2.5时判定为ASFV抗体阳性（+），2.5＞S/N≥2.0判断为可疑（±），S/N＜2.0判断为阴性（－）。因此，本研究仅在特异性、灵敏性、重复性试验中单独使用OD450值作为判断标准，而临床样品检测均同时列出OD450值和S/N值。

综上所述，本研究建立了一种针对ASFV P30蛋白的iELISA检测方法。该方法可用于检测ASFV的早期感染，具有较好的特异性、灵敏性和可重复性，同时还可以消除带有His标签的基因工程疫苗免疫后所造成的假阳性反应，是一种有效的ASFV检测方法。

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