非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

2.3 重组蛋白纯化

将纯化后的重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白进行SDS-PAGE电泳。伯乐凝胶成像仪灰度扫描结果（图3）显示，纯化后的重组ASFV P30蛋白纯度约为95%，纯化后的重组ASFV P30-2His6蛋白纯度约为98%。可见，经过Sepharose 300凝胶过滤层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析后的重组ASFV P30蛋白纯度仍稍低于采用Ni-NTA亲和层析纯化的重组ASFV P30-2His6蛋白，重组ASFV P30-2His6蛋白相对分子质量稍大于35 ku。

2.4 重组蛋白Western-blot分析

Western-blot分析结果（图4）显示，重组ASFV P30蛋白的杂交带小于35 ku，而重组ASFV P30-2His6蛋白的杂交带大于35 ku，与预期相符，且杂交条带均清晰，表明两种重组蛋白都具有较好的免疫反应性。

2.5 最佳反应条件设定

按照1.6棋盘滴定法的检测结果（表1），结合设定的优选原则，即阳性血清OD450≈1.0，阴性血清OD450≤0.1，阳性血清和阴性血清的ELISA检测OD450比值（P/N）最高；选定抗原包被浓度20 μg/mL，血清稀释比例1:1 000，酶标第二抗体工作浓度1:40 000。此时临床阳性血清的P/N值最大（19.58），阳性血清的OD450值在1.0附近。

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