非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

根据ASFV P30蛋白编码序列合成1对PCR引物。上游引物起始密码前加上Nco I酶切位点，下游引物添上终止密码子并在3'末端加上Xho I酶切位点。用pET-28a-ASFV P30-2His6为模板进行PCR扩增。扩增产物用Nco I/Xho I进行双酶切，与同样酶切线性化的pET28a质粒连接，获得表达工程菌E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30。

将重组E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6和E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30进行诱导表达。诱导剂为α-乳糖，工作浓度为0.03 mol/L。离心收集表达菌。

1.3 重组蛋白纯化

将收集的经过诱导后的E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30-2His6湿菌体，按照质量体积比1:10，用PBS（0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4）充分重悬，超声破碎处理后离心收集上清，用0.45 μm滤器过滤上清，获得预处理蛋白液。采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化ASFV P30-2His6重组蛋白。

将收集的经过诱导后的E.coli.BL21/pET-28a-ASFV P30湿菌体，按照质量体积比1:10，用0.1 mol/L pH10.53的碳酸缓冲液充分重悬，超声破碎处理后离心收集上清，用0.45 μm滤器过滤上清，获得预处理蛋白液。用Sepharose 300凝胶过滤层析柱和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行分离纯化。

1.4 重组蛋白检测

对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳以及蛋白浓度测定。使用Western-blot对纯化后的两种重组蛋白进行分析。用12%的分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印至NC膜上；使用ASFV阳性猪血清作为一抗（稀释倍数为1:5 000），37 ℃孵育1 h，用1×PBST（含有0.05% Tween-20的PBS缓冲液）洗3次，10 min/次；加入HRP标记的山羊抗猪IgG抗体（1:20 000稀释）作为二抗，37 ℃孵育1 h，用1×PBST洗3次，10 min/次；使用ECL化学发光试剂盒，按照操作方法曝光显色并拍照分析结果。

1.5 iELISA检测方法建立

采用棋盘滴定法，将纯化后的重组ASFV P30蛋白用包被液（0.05 mol/L碳酸缓冲液，pH9.5），按照标准稀释法稀释至质量浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL，包被ELISA板，每孔加样100 μL，25 ℃孵育4 h后空干包被蛋白液；用包被液（0.01 mol/L磷酸钾缓冲液，pH7.2）每孔200 μL清洗3遍后空干；再加封闭液（5%脱脂奶粉溶液）200 μL，25 ℃封闭2 h，封闭完成后倒尽封闭液，空干待用。用封闭液对ASFV阳性和阴性血清分别进行倍比稀释（稀释比例分别为1:500、1:1 000、1:2 000、1:4 000），同时将HRP标记的羊抗猪酶标记抗体用1×PBST缓冲液稀释，稀释比例分别为1:10 000、1:20 000、1:40 000；按照常规iELISA方法操作，保证洗涤完全，用终止液（2 mol/L硫酸溶液）终止反应后读数OD450。选择标准：OD450≈1.0，阴性血清OD450≤0.1，阳性血清和阴性血清的OD450比值（P/N）最高。

分别选择1%明胶溶液、2%牛血清白蛋白溶液、5%脱脂奶粉溶液、10%胎牛血清作为封闭液，封闭2 h，分别用ASFV阴、阳性血清进行ELISA试验，选择最佳封闭液。

1.6 ASFV 抗体阳性临界值确定

取70份ASFV临床阴性猪血清，采用优化的ELISA方法进行检测。计算OD450平均值和标准偏差，按照阳性临界值=平均值+5×标准差，确定该ELISA方法的OD450临界值；设临床样品OD值/阴性样品OD值（S/N）大于2.5为阳性临界值，大于该数值判定为ASFV抗体阳性，反之则为抗体阴性。

1.7 特异性试验

以上述建立的iELISA检测方法，对PPV、PRRSV、FMDV、SVA、PCV2和PCV3的阳性血清以及ASFV阳性、阴性血清进行检测，根据几种血清检测的OD450值，判定该ELISA检测方法的特异性。

1.8 灵敏性试验

将ASFV阳性猪血清分别按1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400比例稀释，采用优化的iELISA方法，检测不同稀释比例的阳性血清，根据检测结果判定阳性血清的最大稀释倍数，评价该方法的灵敏性。

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