动物源性食品中细菌的检测——沙门氏菌

按照生化鉴定试剂盒操作说明，将以上菌悬液加入20E反应条的各反应孔内，放入反应槽中，置37℃温箱中培养24h。取出后根据说明书观察反应结果，在软件上记录结果，系统将自动出现检测结果。所得反应的类型必须以数字化形式记录在报告单中，每3个测定为一组，每个以1、2和4标明，在每组中，阳性反应以相应的数字相加，由API20E的20个测定可得一个7位数，通过分析即可鉴定获得细菌类型。

5.3 分子生物学鉴定方法

用PCR进行鉴定，亦可根据5.1.2（1）的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用无菌去离子水制成菌悬液，水浴煮沸10min，3000r/min离心5min，以上清液为模板，进行扩增。上游引物为：5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′，下游引物为：5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3′。反应体系：10×buffer5μL，TaqDNA聚合酶（2U/μL）1μL，氯化镁溶液（25mmol/L）5μL，dNTP（2.5mmol/L）5μL，ddH2O29μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，模板1μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，PCR产物用1.5%的琼脂糖在100V条件下进行电泳，得到扩增长度为284bp的扩增产物为沙门氏菌阳性。

5.4 VIDAS鉴定方法

用可疑菌落制成菌悬液或以下方法培养菌液以备检测：

（1）预增菌 无菌方法在225mL缓冲蛋白胨水中加入25g（25mL）待检样品，混合混匀后，35～37℃孵育16～20h。

（2）选择性增菌 孵育之后，转1mL悬液至10mLSC肉汤中（或1/10稀释）。35～37℃孵育6～8h。同时转0.1mL预增菌肉汤至氯化镁孔雀绿大豆（RVS）肉汤中，41～42℃孵育6～8h。

（3）后增菌 孵育之后，从SC肉汤中转1mL至M肉汤，从RVS肉汤中转1mL至另一份M肉汤。

孵育之后，混匀肉汤，从两份M肉汤中各取1mL加入一个试管封口并在95～100℃水浴中加热15min。冷却后进行VIDAS鉴定。

（4）将所需试剂取出，使其恢复至室温（至少30min）。

（5）每个样品使用一条SLM（沙门氏菌）试剂条及一个SLM固相容器，先必须做好质控和校正。确保取出试剂后，将装有剩余固相容器的袋子重新密封好。

（6）输入所需的信息以便建立工作类列表（work list），键入“SLM”至检测编号，再输入将要检测待检样品的试验号。标准（S1）必须在work list的首位并做双份，随后是质控（C1）和（C2）。

（7）吸取500μL的质控或样品至SLM试剂条样品孔。依屏幕所示，将固相容器和试剂条放入仪器的相应位置。核对位置以确保固相容器上3个字母编码的颜色标记与试剂条相符。

（8）根据操作手册进行检测。所有分析过程都由仪器自动完成。整个过程约需45min。

5.5 乳胶凝集试验方法

用沙门氏菌多价血清致敏乳胶制成的乳胶抗体，建立沙门氏菌乳胶凝集试验检测方法。直接将可疑单个菌落涂布于玻片上，然后滴加乳胶血清，观察其凝集情况。乳胶凝集试验操作简便、快速、敏感性高、特异性强且可用于现场检测，是一种适合基层单位用来检测沙门氏菌的可靠方法。

5.6 ELISA方法

（1）抗原的制备 待检样品在增菌液中增菌后，取1mL增菌液于离心管中，3000r/min离心10min，收集沉淀用PBS洗涤后，用少量PBS悬浮，于水浴锅中煮沸20min，冷却后于4℃保存备用。

（2）包被 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加50μL制备的抗原，于50～60℃烘干，冷却后，加甲醇固定5～10min，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。

（3）加酶标抗体 于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）50μL。37℃孵育2h，洗涤。

（4）加底物液显色 于各反应孔中加入临时配制的TMB（3，3，5，5-四甲基苯胺）底物溶液50μL，37℃孵育20min。

（5）终止反应 于各反应孔中加入2mol/L硫酸50μL。

（6）结果判定 可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”“－”号表示。也可测光密度（OD）值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。每次试验设阴、阳性和空白对照。

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