非洲猪瘟病毒细胞传代致弱株研究进展

从1976年开始，有研究人员将BA71株（1971年分离自西班牙巴达霍斯省一发病猪脾脏，已在猪骨髓细胞传代36代）在Vero细胞上适应传代100代，最终获得无致病力的Vero细胞适应株（BA71v)。1979年，Thomson等使用致弱的CV毒株（1962年分离自南非，在细胞上连续传44代致弱）接种2头猪，发现使用强毒株攻毒后不能产生足够的保护力。俄罗斯国家兽医病毒学和微生物学研究所（National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology,VNIIVVi M）也制备了多株细胞传代致弱株，如刚果KK-262株（将刚果1949年分离株在猪肾细胞传至50代后再在猪骨髓细胞传262代）和法国FK-32/135株（将法国1964年分离株在猪骨髓细胞上传135代）等。但上述毒株未进行免疫接种及攻毒保护试验。

1981年，Ruiz-Gonzalvo等将E75强毒株（1975年分离自西班牙）在猴肾成纤维细胞（CV1）上连续传4代，获得E75CV1毒株（也称258-CV1-4），将其接种25头家猪后发现有20头猪存活，且能部分抵御同源强毒株的攻击。后期研究使用类似策略对E70强毒株（1970年分离自西班牙）进行了更多代次传代，如MS14和MS44（在猴肾细胞分别传14代和44代），但其主要目的是将该毒株用于基因组比对分析或作为代表毒株进行毒力基因研究。2015年对E75CV1进行更深入研究时发现，该毒株以105和102 HAU50剂量肌肉注射接种家猪出现部分死亡，以104 HAU50接种却能全部存活且能抵御同源毒株攻击。

2007年ASFV传入格鲁吉亚并相继传入俄罗斯、罗马尼亚、德国等东欧、中欧国家后，该病毒研究方向开始向基因II型毒株倾斜。2015年，Krug等将格鲁吉亚毒株（ASFV-G)Vero细胞适应株第30代、60代、80代和110代传代毒株进行全基因序列分析和攻毒保护试验，结果发现Vero细胞适应株全基因组序列在左臂和右臂特定位置发生了渐进性丢失，各代次毒株以104 HAD50剂量接种易感猪后，第110代毒已无任何临床反应，但攻毒后无法提供有效保护。

2015年Balysheva等将Stavropol 01/08强毒株在猪肾胚胎细胞系与猪淋巴细胞混合细胞系上（the hybrid cell line SPEV TK with pig lymphocytes,A4C2）传14代、24代和33代，在CV细胞和猪肾细胞（PSGK-60）上分别传20代，结果发现A4C2/9k细胞的14代毒和PSGK-60细胞的20代毒均表现强毒特性，接种猪全部死亡。A4C2/9k细胞的24代、33代毒和CV细胞的20代毒毒力减弱，接毒猪全部存活，但无法保护猪免于强毒株攻击。

2020年，俄罗斯联邦病毒学和微生物学研究中心（原全俄兽医病毒学与微生物学研究所）Alexey等将其实验室研制的弱毒株按照血清群分类进行了详细比对分析。这些弱毒株绝大多数通过细胞传代致弱（主要是猪骨髓细胞），如血清I型的LK-111株、Katanga-350株，血清II型的KK-202株，血清III型的MK-200株，血清IV型的FK-32/135株，血清V型的TSP-80/300株，血清VI型的TS-7/230株，血清VII型的UK-50株和血清VIII型的RK-30株。这些毒株均已致弱并可对强毒株攻击提供不同水平的免疫保护。

ASFV细胞传代致弱株是疫苗研究历史中的重要组成部分，也是未来有望推向市场的候选方向之一。如欧盟正在主导实施疫苗研制计划（Vacdiva project），将俄罗斯研制的传代细胞适应弱毒株（Arriah CV-1株）作为未来重点研究的3个疫苗候选株之一。此外，经过大量比对试验验证，俄罗斯联邦病毒学和微生物学研究中心挑选出的FK-32/135株也具有较好的研究潜质，但仍需对其接种途径进一步研究探索（模拟自然感染途径）。

2 细胞传代致弱株研究意义

在ASFV传播的100年中，很多国家曾经借助严格的生物安全防控措施成功净化了ASFV。但是ASFV具有致死率高，低温环境抵抗力强，可借助冷冻猪肉制品、泔水和软蜱传播等特点，使得该病的疫苗使用需求高于其他疫病。2017年，欧盟发布ASFV疫苗可行性发展线路图，仍将研制ASFV疫苗放到了控制和根除ASFV的重要位置。早期ASFV弱毒株研制主要通过细胞传代方式致弱，如BA71v,E75CV1等。但增加传代次数会导致ASFV毒力降低，难以提供对亲本毒株的攻毒保护，因而很难找到合适的传代次数进行后续动物试验，具有一定的盲目性和随机性，更无法预判攻毒保护效果。因此，相较于减毒疫苗株制备，细胞传代致弱株/适应株在其他方向，如滴度测定方法建立、基因组功能研究和致病机理研究等方向发挥的作用可能更大。特别在全基因组比对分析研究中，通过细胞传代致弱株丢失基因的区域分析，对于基因敲除弱毒疫苗研究具有很好的指导借鉴作用。如，格鲁吉亚株（ASFV-G）在Vero细胞上连续传至60代后，其I177L基因编码氨基酸序列发生了1个点突变（第42位由脯氨酸变为丝氨酸），这可能为后期I177L基因缺失株研制提供了一定线索。同时，20世纪60年代在西班牙和葡萄牙大范围使用弱毒疫苗（在猪骨髓细胞上连续传代所得）导致的“免疫失败事件”，使得科学家认识到接种猪本身的免疫机能状态会影响弱毒苗效果。如，无红细胞吸附活性的Kc-160株，以107.5 TCID50的剂量接种健康家猪，会有75%～80%的猪出现轻微或中等临床反应，但接种免疫机能降低的猪会发生20%的死亡。

因ASFV一般不适应在传代细胞系中繁殖，所以传统的细胞传代致弱株在传代细胞系连续传代之前都需要进行一定的驯化，这也在一定程度上限制了弱毒疫苗株进行产业化大规模生产。但近期有多篇报道称找到了支持ASFV高效复制的传代细胞系，如A4C2/9K、WSL（野猪肺细胞）、MA104（猴肾细胞）、ZMAC-4（胎猪肺巨噬细胞）和IPKM（猪肾巨噬细胞）等。这些细胞系都在一定程度上满足了ASFV连续传代的科研目的，但连续传代后是否像其他细胞系一样发生基因丢失或免疫原性改变等，仍需大量试验验证和探讨。

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