非洲猪瘟病毒细胞传代致弱株研究进展

摘要：目前非洲猪瘟（African swine fever,ASF）仍无疫苗可用，使得该病防控难度较高。早期非洲猪瘟病毒（ASFV）的弱毒株研制主要通过细胞传代方式。经过国外多年研究积累，现已经在多种细胞上获得毒力致弱毒株。细胞传代致弱株是ASF疫苗研究的候选方向之一，且对于基因敲除弱毒疫苗研究具有很好的指导借鉴作用。国内目前尚无这方面的调查研究，为此对国际上ASFV细胞传代致弱毒株相关研究进行整理，分析其传代致弱规律，以期为我国ASFV细胞适应株研究及新型疫苗研制提供参考。

自1921年报道以后，在很长一段时间里非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）一直在非洲流行，并没有引起大多数国家，特别是主要猪肉生产国的重视，直到1957年ASFV传入葡萄牙、1960年传入西班牙后才引起国际广泛关注。1957年，葡萄牙因ASFV传入导致损失17 000头猪后才开始研究ASFV，发现ASFV感染的红细胞吸附现象和ASFV可以在细胞上繁殖传代。早期研究就已发现，分离强毒株在细胞上连续传代后再次接种猪不再出现典型的临床症状，而且这些猪可以经受住同源强毒株的攻击。但后期的一些研究却发现，某些毒株在传代细胞系连续传代后虽然毒力减弱，却不能提供同源保护。同时，不同ASFV在不同细胞上的适应性传代结果并不相同。面对上述进展，国内尚无专业材料进行论述，因此本文将对国际上ASFV细胞传代致弱毒株相关研究进行整理，分析其传代致弱规律，从而为我国ASFV细胞适应株研究及新型疫苗研制提供参考。

1 细胞传代致弱株研究历程

自1957年ASFV传入葡萄牙后，就在西欧逐步扩散蔓延并传至南美洲。因流行毒株只有基因I型，早期研究主要使用基因I型毒株进行细胞适应研究，代表适应株如L'60BM89、BA71v、E75CV1等。ASFV细胞适应株研究最早开始于20世纪60年代，首先研究的母本毒株主要有Lisbon 60毒株（1960年分离自葡萄牙里斯本发病家猪）、葡萄牙分离株1455(1961年分离自葡萄牙）和Hinde毒株（分离自肯尼亚）。1961年，Ribeiro等将Lisbon 60毒株在骨髓细胞传代89代后（L'60BM89），又在Vero细胞上继续传代15代，证明ASFV可在传代细胞系繁殖。1963年，Ribeiro等又将葡萄牙1455毒株在骨髓细胞上连续传代并发现其毒力逐渐致弱。葡萄牙1455毒株传代至40代后接种动物仍可导致典型的临床症状，当传代至70代时，临床症状大大减轻并能抵御强毒株攻击。

1962年，Malmquist等将Hinde毒株（分离自肯尼亚）在猪肾细胞（PK-2a）上传代，当传至75代或更高代次后（90、103和104代），发现传代毒株接种猪完全存活；使用90代毒株免疫猪后再使用亲本强毒株接种（105 TCID50），发现接种猪均死亡，但先使用103代毒株免疫再使用50代毒株免疫的接种猪能抵御亲本强毒株攻击，证明细胞传代致弱毒株可以产生部分保护力。1963年Botija将5株西班牙分离株在PK-2a细胞和白细胞上连续传代，也发现毒力减弱，其中一株毒株在传至60代以后对猪无任何致病力。1965年Hess等也利用PK-2a细胞传代致弱多株ASFV,1974年利用幼仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells,BHK21）传代致弱Tengani毒株。

1967年，Bannister等使用葡萄牙疫苗候选株进行动物试验。该毒株以Lisbon 60毒株为母本，在猪骨髓细胞上继续传至81代所得。疫苗株接种1头猪后（114号），将第3天体温反应最大时采集的肝素抗凝血肌肉注射另外4头健康猪（115、116、117和118号），结果未出现体温升高和临床反应。接种后第71天，4头猪饲喂含有葡萄牙强毒株的血液和组织，进行口腔感染试验（第1次攻毒），4头猪均未出现体温升高和临床反应。为进一步验证疫苗效果，对其中的2头猪（115和117号）在第87天时（饲喂强毒后第16天），进行第二次攻毒试验（肌肉注射3 m L强毒血液），结果115和117号猪初期均未出现体温升高和临床反应，但115号猪在第108天后（第2次攻毒后第22天）开始出现4轮温度上下波动随后逐渐升温，直至按计划扑杀时达到最高温度（41.3℃）。同年，Greig等[13]对Spencer株（1951年分离自南非约翰内斯堡）、Portuguese challenge株（分离自葡萄牙）、Gasson株（1950年分离自肯尼亚）进行细胞连续传代并使用亲本毒株攻毒验证，结果发现Spencer株传至35代后，接种猪无临床症状且能保护接种猪免受亲本毒株攻击；Portuguese challenge株传至34代后，接种猪出现体温小幅波动且能为接种猪提供针对亲本毒株的保护；Gasson株传至23代后，接种猪毒力减弱但不能保护接种猪免受亲本毒株攻击（接种2头猪，其中1头死亡，1头升温后恢复正常但未能抵抗亲本毒株攻击）。

1968年，Stone等利用致弱的Lisbon 60毒株肌肉注射免疫22头猪（接种剂量每头105TCID50/m L）并于免疫后第117天进行同源毒株攻毒试验（使用Lisbon 60攻毒发病猪脾脏匀浆液，稀释至104 LD50）。所有免疫猪健康存活，但随后攻毒的18头猪中有17头猪出现体温反应，其中4头死亡；攻毒后第23天扑杀存活的14只猪，制备肺脏和脾脏混合匀浆液并继续接种2头健康非免疫猪，结果2头猪均死亡。同年，Coggins等将肯尼亚强毒株（Hinde WH II virus)和乌干达强毒株（Uganda ASF virus)[16]在细胞上连续稀释传代，发现部分毒株的红细胞吸附功能丢失，但继续更换到猪体内传代，可能会重新获得红细胞吸附功能。无红细胞吸附功能的毒株毒力减弱，接种猪后大部分猪存活并能抵御强毒株攻击。

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