非洲猪瘟病毒核酸定性检测方法比对

2.3　荧光 PCR 商品试剂盒检测

根据试剂盒结果判定要求，阳性对照 Ct ＜30 且出现特异性扩增曲线，阴性对照无 Ct 值或Ct ≥ 40，说明检测结果有效。在此基础上，被检测样品 Ct ＜ 40 且出现特异性扩增曲线，判定为阳性，结果与阴性对照一致的判定为阴性。检测结果（图 3）显示，阳性、阴性和空白对照均符合质控要求。其中：20、86 号样品扩增信号较强，Ct 值分别为 22.5 和 22.9，判定为阳性；69、73 号样品扩增信号较弱，Ct 值分别为 29.2 和 29.4，判定为阳性；15 号样品无扩增信号，无 Ct 值，判定为阴性。

图 3 ASFV 荧光 PCR 商品试剂盒检测结果

3　分析与讨论

ASFV 实验室检测是严防 ASF 疫情发生的重要环节。ASFV 核酸检测的方法有普通 PCR、实时荧光定量 PCR、微滴数字 PCR（ddPCR）、原位杂交（ISH）、环介导恒温扩增技术（LAMP）和重组酶扩增技术（RPA）等。目前，ASFV 检测的主要依据有行业标准 SN/T 1559—2010《非洲猪瘟检疫技术规范》、国家标准 GB/T 18648—2020《非洲猪瘟诊断技术》以及 OIE TerrestrialAnimal Health Code 第 2.8.1 章中 ASFV 检测方法。

其中 PCR 技术因具有快速、高效等优势成为主流检测手段。本次比对验证选择行业标准中的普通 PCR、荧光定量 PCR 和国家批准的商品化试剂盒（荧光定量 PCR 方法）相互验证。比对发现，3 种方法结果一致，验证结果为“满意”。普通PCR 具备灵敏度高、成本低以及对样本纯度要求低等优点，适合没有荧光定量 PCR 仪的基层实验室；但 PCR 扩增产物需在开盖后进行琼脂糖凝胶电泳以观察特异性条带，开盖过程易造成交叉污染出现假阳性。荧光定量 PCR 特异性强、重复性好、自动化程度高并且不易污染样本和环境。商品化试剂盒将荧光定量PCR所需的试剂整合在一起，操作更加简便，检测结果一致性高，是 ASFV 日常防控检测和实验室比对的指定方法。

选用 SN/T 1559—2010 标准方法开展检测时，需获得阳性对照。为防止病毒污染，宜选用含有目标基因片段的阳性质粒。将标准中的引物序列在 NCBI 网站上进行比对，发现该引物的序列信息为 ASFV 结构蛋白基因 p72，通过合成本段序列可获得阳性质粒。因质粒 DNA 的拷贝数很高，实验室在使用过程中要防止污染，应将质粒 DNA 适当稀释后分装保存备用。选用商品化试剂盒检测时，要选用获得农业农村部批准文号的产品，以保证检测结果的合法性和可靠性。因相关政策法规实时更新，产品批准文号信息可在中国兽药信息网“兽药基础数据库”中随用随查。

比对验证是评价实验室技术能力的有效手段。通过此次验证，进一步确认了实验室人员、仪器、方法以及环境各方面均需满足 ASFV 检测要求。本次验证同时提高了检测机构的公信力，为及时发现和防控 ASF 疫情提供了技术支撑。

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