非洲猪瘟病毒核酸定性检测方法比对

摘要：为提升兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测能力和质量控制水平，积累检测经验，以更好地开展非洲猪瘟检测，2020年7月，参加了北京市农业农村局组织的“非洲猪瘟实验室检测能力比对”项目。本次比对同时选用《非洲猪瘟检疫技术规范》（SNT 1559—2010标准）中的普通PCR方法、荧光定量PCR方法以及商品化试剂盒，对5份验证样品开展非洲猪瘟病毒核酸检测和结果比对。比对发现，3种检测方法结果一致，样品检测结果与预期一致，结果满意。此次比对确认了实验室现有检测方法能够满足非洲猪瘟病毒核酸的日常检测需求，同时提升了实验室人员的检测能力，积累了检测经验，可为非洲猪瘟防控提供有力的技术支撑。

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员，对家猪和野猪具有高度传染性和致死性，可引发非洲猪瘟（African swine fever，ASF）疫情。ASFV 是双股线状 DNA 病毒，呈复杂的正二十面体结构，可在低温、高湿环境下长期生存，能适应 pH3~11 的宽泛酸碱环境。ASFV粒子基因组大、易变异，编码蛋白种类多；病毒存活力强，能够通过多种方式和途径进行有效传播，潜伏期因传播方式而异，这是其在全球传播的重要原因之一。1921 年，肯尼亚报道了全球首例 ASF 疫情，随后该病在多个国家和地区广泛流行，2018 年8 月，我国出现首例 ASF 疫情，尽管有关部门迅速采取扑杀等控制措施，然而疫情仍蔓延至全国，对我国养猪业造成严重经济损失。由于 ASFV的高致病性、传染性和致死性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASFV 核酸检测是其防控工作的重要措施之一。自疫情发生以来，农业农村部先后发布了多项有关诊断试剂、病毒检测和实验室管理方面的政策。根据北京市农业农村局 ASF 防控工作的有关要求，为确保北京市各 ASF 实验室检测标准的一致性和结果的可靠性，2020 年 7 月，本实验室参加了北京市动物疫病预防控制中心组织实施的ASF 实验室检测能力比对。参照 SN/T 1559—2010标准中的普通 PCR 方法、荧光 PCR 方法以及使用已取得农业农村部批准文号的试剂盒，对血清样品开展检测比对，以期为兽医实验室 ASFV核酸检测提供参考。

1　材料与方法

1.1　样品、试剂

能力比对血清样品（5 个，编号分别为 15、20、69、73、86），由北京市动物疫病预防控制中心提供；DNA 病毒基因组提取试剂盒、ASFV 荧光 PCR 检测试剂盒，均购自青岛立见诊断技术发展中心；TaqMan PCR Master Mix、ExTaq 聚合酶，均购自北京奥今东方科技有限公司；引物、探针和ASFV 核酸阳性质粒，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2　仪器设备

Quant Studio 6 Flex 荧光定量 PCR 仪、9700PCR 仪，购自美国 ABI 公司；INFINITY 3000 凝胶成像系统，购自法国 Vilber 公司。

1.3　方法

1.3.1 DNA 提取　参照 DNA 病毒基因组提取试剂盒方法，提取样品 DNA。

1.3.2　普通 PCR 检测　使用 SN/T 1559—2010 标准中的引物进行 PCR 扩增。引物序列见表 1。每个反应管中包含 50.00 μL 反应体系：1.25 mmol/L 的dNTP 8.00 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，终浓度 0.40 pmol/L 的上下游引物各 1.00 μL，DNA 模板 5.00 μL，最后用双蒸水补齐至 50.00 μL。PCR 反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环；最后 72 ℃ 10 min。

1.3.3　荧光定量 PCR 检 测　 使 用 SN/T 1559—2010 标准 [16] 中的引物和探针进行荧光定量 PCR扩增。引物序列见表 1。每个反应管中包含 25.0 μL反应体系：2×TaqMan PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，探针 1.0 μL，DNA 模板 5.0 μL，最后用双蒸水补齐至 25.0 μL。荧光定量 PCR 反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，58 ℃1 min，40 个循环。

表 1　普通 PCR 和荧光定量 PCR 引物探针

1.3.4 ASFV 荧光 PCR 试剂盒检测　使用商品化试剂盒中的引物探针进行荧光定量 PCR 检测，反应体系和扩增条件均按说明书推荐操作进行。

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