牛结节性皮肤病的诊断与防治（二）

摘要：结节性皮肤病（LSD），是一种新兴的跨界病毒性痘病，影响所有年龄和品种的牛。是由山羊痘病毒属结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus, LSDV) 引起的传染病, 牛和亚洲水牛均可感染，是牲畜的病毒性疾病，可引起皮肤和内部损害，影响牛奶产量，生皮质量，并可导致被感染动物死亡。采血液，使用实时聚合酶链反应（PCR）在实验室对死亡和怀疑感染的动物和牛的内脏或病变进行测试。对其可采取包括行动限制，病媒控制和疫苗接种在内的预防措施，以减缓疾病的传播。

1 病原

病原是结节性皮肤病病毒（LSDV），属DNA 病毒羊痘的痘病毒家族包括羊痘病毒（SPV），山羊痘病毒（GPV）和LSDV，具有97％的核苷酸同一性，并且在血清学上具有交叉保护作用。尽管Capripox 的其他菌株感染绵羊和山羊，但LSDV与牛有关。LSDV 以两种传染形式存在：具有单个外膜的成熟病毒体（MVS）和专门用于细胞间扩散的包膜病毒体（EV）具有附加膜。

2 简介

宿主对LSDV 感染的易感性受许多因素影响。CaPV 感染的免疫主要是细胞介导的，因为大多数子代病毒仍保留在被感染的细胞内。通过在本地直接在细胞之间传播，该病毒不在循环抗体的范围内。通过从受感染细胞中萌芽释放的细胞外包膜病毒体，可能感染邻近细胞或逃逸到血液中，并在全身传播。LSDV 的传播是通过蚊子，苍蝇和蜱。

已知对牛的LSDV 感染具有天然抵抗力，并且亚临床LSDV感染很常见。LSDV 造成重大的经济损失，主要是由于导致牛奶产量严重下降，体重减轻，流产，不育和生皮损害。为了成功地控制LSD，所有易感动物的疫苗接种被认为是主要支柱，并辅之以其他控制措施，例如扑灭，动物移动限制和媒介控制。

3 临床特征

该疾病的特征是发烧、皮肤黏膜和内脏器官上的结节性病变。可能会出现牛奶产量减少，生皮受损，暂时或永久不育和受感染动物死亡的情况，从而在受影响的国家造成重大的经济后果。临床体征的严重程度取决于病毒的株系和被感染牛的品种。传播主要是通过叮咬昆虫的间接接触。LSDV 的平均潜伏期为6 ～9d。该疾病的平均死亡率约为10％。

4 材料与方法

动物和组织采样 从受影响的动物中收集生物标本。在实验室进行检测。从患病动物的脖子和头部收集结节性皮肤病变的皮肤刮擦5mL 血样。尸检是对表现出与LSD 一致的病死牛进行的。从这些动物中收集肺，肾，肝和心脏的一小部分进行测试。

制备样品，在提取DNA 之前，将皮肤样品置于磷酸盐缓冲液（1X PBS）中1h。一块（约1.3cm2 用剪刀将每个内部器官（肝，肾，心脏和肺）切成小块，并汇集在一起（总量不超过5g）。使用研钵和研棒，少量研磨加入8mL 1×PBS 的样品。将样品（皮肤或合并的内部器官）匀浆。匀浆后，将浆液倒入15mL EP 中，并以8000 rpm 离心10min。将所得的上清液中提取DNA。试剂盒还可用于从血液样本中提取DNA。研钵和研棒之间用漂白剂消毒。

实验室检测：

抗体检测：采集全血，分离血清用于抗体检测，可采用病毒中和试验、酶联免疫吸附试验等方法。

病毒中和试验 使用标准程序测试血清样本（n= 80），该程序将中和指数确定为首选方法。针对恒定稀释的测试血清滴定病毒株。以此方式，需要更大体积的测试血清，但是消除了确保50％组织培养物感染剂量（TCID50）为100 的困难。根据可用的OIE 程序，使用羊睾丸（LTe）细胞在96 孔板中进行测试。

病原检测：采集皮肤结痂、口鼻拭子、抗凝血等用于病原检测。病毒核酸检测可采用实时PCR 等方法，病毒分离鉴定可采用细胞分离培养病毒，动物回归试验等方法。

实时PCR 测试 内部器官样本进行检测。使用Taq 聚合酶，10x PCR 缓冲液，50mM MgCl2 和10mM dNTPs 制备PCR 主混合物。将总共5μL 提取的样品DNA 或模板对照添加到15μL 制备的预混液中，总体积为20μL。使用对应的热循环条件，在PCR 仪器上进行反应。在样品测试之前，将阳性模板对照（PTC）从1pg/μL 连续稀释至0.001fg/μL，并在PCR 仪器上运行。合成循环阈值（C T）vs. PTC浓度曲线的对数给出3.76 的斜率，对应于92％的扩增效率（每个循环100％加倍）。根据标准曲线，在后续测量中使用浓度为1 fg/μL 的PTC。

5 控制措施

对患病动物的治疗因情况而异，但通常包括使用碘对皮肤病变进行消毒以及用磺胺治疗继发性细菌感染。采取预防措施，包括控制动物的活动以及限制车辆进入受影响农场的交通。