非洲猪瘟病毒检测方法研究进展

2.1.4 交叉引物扩增法

交叉引物扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)是使用Bst DNA聚合酶及多个引物和探针的新型等温扩增反应技术，是1种快速、灵敏且特异性高的等温扩增方法。CPA通常需要1套3～8个互补引物，这些引物可识别已鉴定的DNA中的特定基因座，并使用具有等温作用的聚合酶(如Bst、Bsm或GspSSD)，表现出很强的链置换作用。添加可结合双链反应产物的荧光染料(如SYBR GreenⅠ)，在紫外光下可观察到结合形成的荧光双链DNA产物，阳性样品呈绿色荧光，阴性样品不显示任何荧光。该方法的特点是灵敏度高，无需提取病毒DNA。

2.1.5 聚合酶交联螺旋反应

聚合酶交联螺旋反应(Polymerase cross-linking spiral reaction,PCLSR)需要使用3种特异性引物，2个外部螺旋引物，其包含与ASFVp72基因序列互补的3’序列和与外源基因互补的5’末端序列，以及ASFV特异性交联引物。Woz'niakowskiG等基于p72基因设计了1组CPA引物进行ASFV扩增，结果显示与家猪、野猪的其他病毒没有交叉反应，特异性较高。该方法已用于感染猪血液和血清中ASFV遗传物质的快速直接扩增，特异性和灵敏度高，不会与古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的cDNA发生交叉反应。使用SYBR GreenⅠ染料PCLSR可实现结果的可视化，同时使用实时PCR系统可追踪反应进程，可记录荧光曲线和溶解峰值。

2.2 病毒分离法(红细胞吸附实验)

病毒分离法是ASFV重要的病原学诊断技术，但该方法对生物安全等级、技术条件等方面要求苛刻，只能在农业农村部指定的实验室开展。ASFV可以感染猪的多种白细胞，并在其中复制，感染后的白细胞能够吸附猪红细胞，吸附后48～72 h裂解，目前还未发现猪的其他病毒具有这种特性。因此，红细胞吸附试验仍然是较敏感的ASFV检测技术。该方法的缺点是相对耗时费力。

2.3 血清学检测

2.3.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，检测相应抗体或抗原的方法。该法检测ASFV抗体方法包括间接ELISA和阻断ELISA 2种，所用的包被抗原不尽相同。为提高敏感性，Cubillos C等利用p30重组蛋白(p30r)建立ELISA检测方法，用于多个地区的ASFV血清学诊断，能够准确检测ASFV抗体;仇华磊以原核表达重组VP72作为抗原建立ELISA检测方法具有很高的敏感性。ELISA检测方法敏感性高，但若样品保存不好、出现腐败变质等情况会导致敏感性降低。

2.3.2 双抗体夹心ELISA法

双抗体夹心ELISA是将特异性单克隆抗体包被聚苯乙烯微量反应96孔板，作为捕获抗体加入酶标液的待检样品如果含有ASFV抗原，则能与单克隆抗体特异性结合形成酶标复合体，洗涤净化复合物，加入底物，发生酶催显色反应，有色产物量与ASFV量相关联，从而实现对ASFV的定性或半定量检测。该方法具有快速、高通量、费用低等特点，但检测敏感性相对较低。

2.3.3直接免疫荧光试验

用荧光素标记抗ASFV特异性多抗或者单克隆抗体，然后将荧光素标记抗体与组织压片、触片以及冷冻切片上的抗原直接进行反应。直接免疫荧光抗原检测特异性、敏感性较高，但该方法对实验室的生物安全防护条件、操作技术及仪器设备要求较高，应用受到一定限制。

2.3.4 间接免疫荧光试验

将感染ASFV的原代细胞或传代细胞固定于细胞板或载玻片上，加入待检血清样品，如果被检血清中含ASFV特异性抗体，就会与细胞中的ASFV抗原结合，并与荧光素标记的二抗特异结合形成荧光复合物，显微镜下观察该复合物可做出定性或半定量判断[31]。间接免疫荧光试验对试验条件及操作要求较高。

2.3.5 免疫印迹试验

免疫印迹是1种快速、准确检测和识别蛋白质的方法。Kazakova A S等[32]制备高纯度的重组蛋白p30(ASFV内膜的一部分，是1种早期蛋白)，应用于ASFV免疫印迹诊断方法，可在感染后6～8天从家猪或野猪血清样品中检测ASFV特异性抗体。该法对实验设备、操作技术有较高的要求。

2.3.6 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析是将胶体金标记、免疫层析及新材料免疫等技术相结合，通过特异的抗原抗体反应对抗原进行检测。胶体金免疫层析技术具有特异性高、操作简单、快速等特点，适合基层快速初诊。如:北京森康生物技术开发有限公司生产的“非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条”用于临床快速检测，但仅限于疑似病猪、死猪ASFV的快速检测，确诊仍需实验室进一步检测。胶体金免疫层析方法除了可以应用于抗原检测，也适用于抗体的检测。2014年张鑫宇等建立了ASFV p54抗体的胶体金检测方法，该法特异性高，与猪的其他病毒抗体阳性血清无交叉反应。林彦星等研发的量子点免疫层析试纸条可快速检测ASFV抗体。胶体金免疫层析法检测假阳性率高，检测结果为阳性的应采用实验室方法进一步确诊，对于检测样品抗原或抗体浓度有一定要求，在病毒感染早期检出率低。

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