基于全面质量管理提升实验室非洲猪瘟病毒检测能力

二是生物安全柜、离心机和核酸提取仪操作问题。这些设备如果操作不当，也会形成气溶胶，导致样品之间发生交叉污染。发生气溶胶污染以后，要尽快通风，增加通风频次和通风强度，开启紫外灯，照射时间延至 2 h 以上，同时用 1%~2% 的 84消毒液进行消毒处理，让机体或腔体中的气溶胶成分充分降解，避免污染不断扩大。

三是移液器腔体的交叉污染问题。检测人员在使用移液器时，移液器的弹簧反复上下移动而吸取液体，一旦存在阳性样品，就容易在腔体内形成气溶胶，然后在吸取另外一份样品时造成交叉感染。因此，应定期开展移液器检测，一旦发现存在污染就要立即采取 84 消毒液擦洗等相应措施，并用样品再次进行验证。

3 检测物料

检测物料包括检测样品（含样品采集和处理）、耗材以及其他辅助用料。这些物料选择不当，也会引起检测结果的“假阴性”和“假阳性”问题。相应的解决方法为：

首先，样品的采集和处理要合理。样品采集尽管不属于实验室检测环节，但样品采集的好坏直接影响后续检测试验的进行。检测 ASF 可供采集的样品种类较多，既可以是抗凝血、血浆、血清、血块，也可以是淋巴结、肝脏、肾脏等组织脏器，甚至是口鼻分泌物、粪便样品以及环境样品等。不管采样时选择哪一种样品，总的原则是选择代表性样品，且不能在采样中引入影响荧光 PCR 扩增的物质。如：在采集猪的全血时，抗凝剂就不能用肝素，因为肝素会强烈抑制 PCR 反应，造成假阴性，所以可以选择 EDTA 钠盐；采集唾液样品时，要加入 DNA 酶抑制剂，且样品采集后应迅速冻存，以免唾液中的酶破坏和降解病毒核酸。

其次，选择的检测耗材要合适。检测中常用的吸头、离心管、荧光 PCR 管等耗材，材质不同，质量也参差不齐，有些劣质的吸头上含有 PCR 抑制剂，可能导致 PCR 出现假阴性，有的吸头表面粗糙，容易残留液体，移液过程可能导致加样量不准，影响荧光 PCR 反应。有条件的实验室可以选择带滤芯以及无 DNA 酶和 RNA 酶的一次性耗材，这样可以避免吸取液体时发生气溶胶的交叉污染以及耗材的不均一性对 PCR 检测结果的影响等。

最后，选择的辅助用料应不影响检测。如：荧光 PCR 反应管 / 反应板的选择要考虑仪器的匹配性，不同型号荧光 PCR 仪使用的 PCR 管有所差异，有使用 100 μL 的，也有 200 μL 的，还有两种型号都使用的；另外，两种型号 PCR 反应管的反应盖帽也有差异，如果不能良好配套，就可能导致PCR 管盖帽多余部分被 105 ℃高温的 PCR 仪热盖熔化。除此，荧光 PCR 仪器的光路有顶部采光、侧面采光和底部采光等多种方式，所以应选择与该仪器匹配的 PCR 管。

4 检测方法

ASFV 荧光 PCR 检测方法包括 ASFV 核酸提取和荧光 PCR 扩增两个主要步骤。核酸提取方法很多，包括浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、柱式法和磁珠法等，不同的提取方法对检测结果有显著影响。浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法无需特殊仪器，但操作繁琐，且提取核酸的质量不高，现在很少使用；柱式提取法和磁珠法的提取效率差别不大，但柱式提取适用于小型实验室或样品数量不多时使用，磁珠法更适用于自动化操作，还可避免柱式提取容易形成气溶胶污染的风险，但需要购买磁珠法对应的核酸提取仪器。不同的实验室可根据自身检测目的、样品种类、检测数量、人员素质、实验室硬件等综合考虑选择适合的提取方法。除核酸提取方法以外，荧光 PCR 扩增也非常重要。自 2018 年底中国动物疫病预防控制中心第一批 ASFV 快速检测试剂盒比对公布以来，国内已有数十家生产厂商取得比对认可，有的厂家已经获得农业农村部批准，这些厂家均可以提供 ASFV荧光 PCR 检测试剂盒。因此，用户在选择检测试剂盒时绝不能贪图便宜选择一些“三无”产品，特别要避免使用伪劣、过期或失效试剂盒。另外，荧光 PCR 方法极其敏感，用户在使用荧光 PCR 检测试剂盒时要仔细对照试剂盒的说明书操作，每次使用时应将试剂盒置于冰上，用完后尽快将试剂盒冷冻保存，试剂盒的冻融次数也不宜过多。

5 检测环境

检测环境是指开展荧光 PCR 检测的环境，包括检测实验室的选址布局、分区设计、室内装修、通风等。如果实验室选址布局科学合理，出现污染的概率就会大大降低。PCR 实验室的设计应当遵循“各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作”的十六字方针。“各区独立”是指要将实验室严格分隔成试剂配制区、核酸提取区、核酸扩增区等 3 个物理上完全独立的功能室，各功能室间不能直接相通。如果各区之间的传递采用传递窗，则传递窗应为密封严实的双开门且带有连锁装置，传递窗内要有紫外灯照射装置，每次打开使用传递窗后都要进行紫外灯消毒，且物品经传递窗传递的路线应该是单向的，要特别注意避免不同区之间的直接相通。各区内都应有缓冲间，避免直接进入试验区域。

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