非洲猪瘟病毒荧光PCR检测假阳性的原因与预防

  二、预防措施

  1、实验室严格分区

  从事分子生物学检测与普通的血凝/血凝抑制（HA/HI）试验、酶联免疫吸附（ELISA）试验不同，微量的核酸污染即可严重影响试验结果的准确性。在设计分子生物学实验室时，必须按照分子生物学试验的具体要求，将实验室严格分隔成试剂配制区、核酸提取区、核酸扩增区、PCR产物分析区等完全独立的功能室，做到对互不相容活动的相邻试验区域形成真正有效的隔离（图1），防止交叉污染的发生。

图1  实验室分区示意图

  2、规范系统设置

  （1）有条件的实验室应尽可能将核酸提取区、核酸扩增区改造成可控气流和各区域内外压差的负压实验室，使气流形成由试剂配制区→核酸提取区→核酸扩增区→产物分析区的定向流动，避免扩增室里的核酸气溶胶回流到样品提取区，这样可以有效保护实验室环境。一级、二级生物安全实验室对于缓冲间没有特殊要求，但规定需要时，可以做负压设计。

  （2）试验人员进入各个操作区域后，要严格单向移动，即试剂配制区→样品提取区→核酸扩增区→产物分析区，不得逆行。

  （3）各个实验区域里的仪器设备应有明显标识，避免不同工作区域内仪器设备和物品的混用。

  3、监测PCR污染

  在检测过程中，可设置试验对照，如阳性对照、阴性对照（包括阴性样本对照和试剂空白对照）。为保证试验的准确性，可将阴、阳性对照设置两个重复，选择不同序列引物进行PCR扩增和重复试验等。

  4、添加必要的仪器设备

  实验室应配备满足检测需求（包括抽样、物品制备、数据处理与分析）的设备和设施，高通量的检测设备尽量做到一用一备。

  5、做好试验前准备

  试剂分装。对PCR扩增体系所需要的试剂，提前分装成小包装存放，分装时选择无核酸酶、无污染的耗材，以及用DEPC（diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）处理过并经高温高压灭菌的纯水；尽量选择在无扩增产物区的生物安全柜内配制和分装，分装好后应标明分装时间，以便发生污染时查找原因。

  耗材选择。有条件的实验室建议使用带滤芯的加长枪头，防止因移液器污染而带来的风险。

  6、加强实验室通风、消毒

  通风。不具备负压条件的实验室，要设置纱门、纱窗，定期通风换气。ASFV是有囊膜的双股DNA病毒，其基因组特征决定了该病毒对环境抵抗力较强，相对于RNA病毒更不易被降解，所以开展ASFV检测的实验室尤其要注意通风换气，减少可能存在的病毒核酸气溶胶污染。

  消毒。通过消毒消除可能存在于实验台、仪器设备、物品等表面的残留核酸。ASFV对环境抵抗力较强，在冻肉中可以长期存活，在肉干和脂肪中可存活将近1年，在血、腌肉和猪下水中存活超过3个月，在粪便中存活超过1周。在尸体腐败过程中，ASFV在数周内仍然保持感染力。所以，开展ASFV检测的实验室要加强检测前后的消毒工作。根据联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization，FAO）和美国动物健康协会推荐，结合实验室实际使用经验，推荐用于ASF试验活动的消毒剂包括0.8%氢氧化钠、含2.3%有效氯的次氯酸盐、3%邻苯基苯酚、3%碘化合物，均为作用处理30 min。配制好的消毒剂，应保存在带盖的塑料容器中，并在使用后确保盖子拧紧。每次试验前后用消毒液擦拭工作台面以及可能接触到核酸的冰箱、门、窗等把手处，用75%乙醇擦拭仪器设备，再用紫外线照射整个实验区域不少于30 min。试验结束后产生的废弃枪头、EP管等废弃物应置于消毒液中浸泡12 h以上，废弃物装入专门的生物安全袋中，经高压灭菌等方式进行无害化处理，避免污染环境。

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