新疆外地输入猪肉水饺的非洲猪瘟病毒检测

摘要：为进一步加强非洲猪瘟防控工作，新疆开展了非洲猪瘟专项监测排查，2018年12月5日，在公路检查站拦截的A厂5个批次速冻水饺样品中，首次检出非洲猪瘟病毒核酸。为防止携带非洲猪瘟病毒的猪肉产品引发疫情，针对公路检查站、冷库及超市的猪肉馅水饺进行排查，随后又在B厂4个批次水饺中检出非洲猪瘟病毒核酸。这是新疆首次连续集中在外地输入的猪肉馅水饺中发现非洲猪瘟病毒，说明非洲猪瘟病毒已形成了一定污染面。因此，要加强产地检疫和屠宰场的实验室检测，继续加大跨省入疆猪肉及其产品的检查和查处力度，严格控制疫区生猪及猪肉产品调入新疆。

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种急性、烈性猪传染病，发病率、致死率可高达 100%，危害严重，对养猪业可造成毁灭性打击，可引起巨大的经济损失和社会影响。ASF自 2018 年 8 月在辽宁省首发以来，已在我国多个省份发生。为进一步加强 ASF 防控，新疆地区加强临床监视、现场排查，对生猪从生产到屠宰全程进行采样监测，严格控制生猪及其产品调运监管，多部门协调联动，形成了良好的工作机制。

2018 年 12 月 5 日，新疆巴州若羌县动物公路检查站在拦截的袋装水饺中采集样品 13 个批次，经新疆动物卫生监督所实验室检测，发现 5 个批次呈 ASFV 核酸阳性。随后，将疑似阳性样品送中国动物卫生流行病学中心复核，确诊为 ASFV 核酸阳性。为进一步了解新疆地区外地输入猪肉水饺的ASFV 污染情况，在该区其他公路检查站和冷库超市开展了 ASFV 排查工作，又连续排查出 4 个批次的外地输入速冻水饺为 ASFV 核酸阳性。这是新疆地区自 2018 年 9 月开展 ASF 专项排查以来，首次排查出输入性猪肉制品携带 ASFV。

1　材料

1.1　样品

样品来源：动物公路检查站拦截的速冻猪肉馅水饺，其中来源于 A 厂 13 个批次、B 厂 1 个批次；在冷库、超市中抽检 B 厂速冻猪肉馅水饺 11 个批次。样品的采集、保存和运输严格按照《非洲猪瘟监测样品采集、保存与运输方法》中的要求，以猪肉产品的批次为采样单位，每批次按猪肉产品包装的规格（件 / 箱）随机抽样。数量为每批次随机抽取 10 件（箱），每件（箱）采集样品 2 份，合计每批次采集样品 20 份。

1.2　试剂

天根磁珠法病毒 DNA/RNA 提取试剂盒（批号S7327）、DNA 病毒反应液（批号 20181129）：购自北京世纪元亨动物防疫技术公司；TaqMan 探针、ASFV 特异性引物、提取阳性对照、反应阳性对照：均由中国动物卫生流行病学中心提供。

1.3　仪器设备

上海博讯电热恒温水槽 SSW-600-2S、Bertin Precellys evolution 高通量组织研磨仪、Sigma3K-15台式冷冻高速离心机、天隆 NP968 自动核酸提取仪、QuantStudio5 实时荧光定量 PCR 仪。

2　方法

2.1　样品处理

每批次每袋随机挑取 2~3 个饺子，挑出其中的猪肉进行剪碎。在加有陶珠的组织研磨管中，加入 1 mL PBS 缓冲液，再加入剪碎的样品约100 mg，使用 Bertin Precellys 组织研磨仪进行匀浆处理。处理后放入 60 ℃水浴锅灭活 30 min，每间隔 5 min 颠倒混匀样品 1 次。

2.2　病毒 DNA 提取

对灭活后的样品 4 ℃ 2 000 r/min，离心 10 min；取 200 μL 上清液，使用磁珠法病毒 DNA 提取试剂盒提取 DNA；将提取的核酸于 −20 ℃冰箱中保存备用。

2.3　荧光定量 PCR

采用 ASFV 特异荧光定量 PCR 方法扩增ASFV VP72 基因片段。PCR 以 20 μL 体系进行：DNA 病毒荧光反应液 10 μL、ROX 0.2 μL、无菌无核酸水 5.7 μL、正向引物 0.8 μL、反向引物 0.8 μL、TaqMan 探针 0.5 μL，模板 DNA 2 μL。同时，设立提取阳性 / 阴性对照、反应阳性 / 阴性对照。密封反应试管，瞬时离心，放入荧光 PCR 仪，按照荧光 PCR 循环条件扩增。

3　结果

根据 ASFV 检测操作规程分析，样品 Ct 值低于 40 为阳性。12 月 5 日检测的 13 个批次样品中，有 5 个批次检测到 ASFV 特异性扩增曲线，Ct 值为 28.3~32.68（图 1），其他批次荧光定量 PCR 检测结果见表 2。

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