非洲猪瘟实验室检测技术研究进展

1.4.2荧光PCR方法

荧光PCR方法是1996年由美国AB公司推出，实现了PCR检测技术由定性向定量的发展。2003年，King等建立的ASF的TaqMan探针荧光PCR方法，该方法是OIE推荐的方法，引物和探针均是根据B646L基因的高度保守区设计，灵敏度比OIE推荐的PCR方法提高10～1000倍。我国董志珍等根据E183L基因设计了引物和探针，建立了ASFV荧光PCR方法，可检出低于15 copies/μL的病毒样品，并获得国家专利。Zask L等建立了TaqMan探针荧光PCR方法，检测临床168份样品，特异性为100%，准确性92.8%～96.4%。王建华等[7]根据ASFV 的CP530R 基因、CSFV 5'UTR 基因和HP-PRRSV NSP2 基因，分别设计了3对特异性引物和TaqMan探针，建立了检测3种病毒的荧光PCR方法对特异性引物和TaqMan 水解探针,可以检出ASFV低于61copies/μL的质粒。目前，荧光PCR方法已广泛应于ASFV的检测，可以在1h内完成检测，在市场上具有成熟的商品化试剂盒，在临床样品的快速检测中起到较大的作用。也有部分试剂盒不用核酸提取，直接扩增，但对样品类型要求较高，敏感性也受影响。荧光PCR方法与PCR方法相比，具有特异性更强、灵敏度更高、重复性好反应更快，自动化程度更高，另外荧光PCR方法不用开盖，解决了PCR方法的污染问题。荧光PCR方法的缺点就是需要使用荧光PCR仪，比较昂贵，检测区域需要PCR分区。

1.4.3数字PCR方法（ddPCR）

数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)，是近年来兴起的一种新的绝对定量PCR技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样品的原始浓度。邬旭龙等根据ASFV 的K205R 基因序列设计了1对特异性的引物和TaqMan探针建立了ASFV的ddPCR方法，最低检测限度可达到0.36copies/μL，在20μL反应体系中约为10copies/μL，检测灵敏度是荧光PCR方法的10倍。数字PCR相比于PCR和荧光PCR，敏感性更强，特异性更高，可以做到病毒含量的绝对定量，在机体低浓度病毒含量的早期感染或潜伏感染的诊断中更加具有潜力，但该方法需要使用昂贵的仪器设备和试剂的成本较高，不适合大规模样品的检测。

1.4.4环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP方法是采用独特的引物设计，利用一种链置换DNA聚合酶，实现等温条件下的高效扩增。2009年，江彦增等根据OIE推荐引物，建立了ASFV的LAMP方法,该方法的敏感性是OIE推荐PCR方法的100倍。2017年，田纯见等根据高度保守的非结构DNA聚合酶G1211R基因，制备质粒标准品，建立实时荧光LAMP方法, 以ASFV的E70毒株病毒核酸为模板，LAMP检测灵敏度达到21pg，优于荧光定量PCR方法,重复性试验LAMP检测批内和批间变异系数均小于5%。LAMP检测方法的优势就是快速、敏感，可以在30min内完成检测，操作简单，并且不需要特殊的仪器设备，该方法更适合用于田间的快速检测，在基层如屠宰场、养殖场更具有广阔的应用前景。但由于LAMP方法具有较高的敏感性，容易出现交叉污染，出现假阳性。

1.4.5重组酶聚合酶扩增(RPA)

RPA方法是一种等温基因扩增技术,模拟了体内的DNA复制。结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单链DNA 结合蛋白（SSB）和链置换DNA 聚合酶3种酶的混合物在常温下即具有活性，反应温度介于37～42℃，可以30min内使目的基因得到指数级增长，采用荧光探针标记，使用荧光信号检测仪，可实现对扩增的实时监控。2016年，王建昌等[11]根据ASFV的P72基因保守序列设计引物，建立了ASFV的RPA方法，该方法的检测限达到100copies/μL，与OIE推荐的荧光PCR方法检测限一致。2017年，李林等根据ASFV的B646L基因保守区设计并合成了特异性引物和exo探针,建立了ASFV的RPA方法，该方法可在20min内完成检测，最低可检测到16copies/μL，与荧光PCR方法具有相似的灵敏度和特异性。采用快速的核酸纯化方法和便携式的荧光信号检测仪，具有快速、特异和操作简单等优点适合基层田间包括养殖场、屠宰场和流通环节的快速检测，在现阶段对于我国防控非洲猪瘟具有重要的意义。

1.5胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法是采用胶体金标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，近年来应用于各种动物疫病抗原和抗体的快速检测。2018年，吴海涛等[13]以原核表达的ASFV的PET-30A-P72蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备血清，以ASFV单克隆抗体杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔内制备腹水，通过纯化获得ASFV的单克隆抗体和多克隆抗体，建立了ASFV胶体金免疫层析法，经测试该试纸条的特异性、敏感性和稳定性表现良好。胶体金免疫层析法操作简单、快速，可以10min内完成检测，不需要仪器读数。根据比对的结果由于该方法的敏感性较差，对于ASFV的检测可能会存在假阴性结果。由于该方法的局限性，当前仅适用于病死猪的ASFV检测。近年来，在胶体金免疫层析技术的基础上开发出了ASFV的荧光免疫层析技术，内含有大量荧光报告分子，荧光信号强而稳定，不受溶剂的影响，具有极强的抗光漂白能力，采用手持式荧光仪读取数值，人为因素影响小，敏感性比胶体金免疫层析技术提高了约100倍。

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