非洲猪瘟实验室检测技术研究进展

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种烈性传染病。我国将其列为一类传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病。1921年首先在肯尼亚记载了该病的暴发，随后相继传入欧洲和南美洲，2007年传入了高加索地区，给当地养猪业和经济造成了较大的影响。2018年8月在我国辽宁沈阳报道了首例非洲猪瘟疫情，随后在我国大多数省份相继发生了非洲猪瘟疫情。由于非洲猪瘟病毒是唯一的昆虫源性DNA病毒，目前尚无有效的疫苗用于非洲猪瘟的预防，防控主要是通过扑杀感染区的猪只来根除疫情，一旦发生疫情将对养猪业造成毁灭性的打击，给肉食品的供应造成严重的影响。所以对于非洲猪瘟的防控措施，“早、快、严、小”显得尤为重要，非洲猪瘟的诊断首先要根据流行病学、临床症状和病理变化等方面作出初步判断，再根据实验室检测结果进行确诊，实验室诊断的原则是快速、准确。近年来，分子生物学检测技术在动物疫病诊断方面得到了广泛的应用，下面将对非洲猪瘟的实验室检测技术进行综述，为非洲猪瘟防控提供参考。

1 病原检测

1.1病毒分离鉴定

病毒分离鉴定是ASF诊断的经典方法，将临床怀疑的样品接种于易感的细胞和猪体内，获得病毒的增殖，然后对分离的毒株进行鉴定。病毒分离鉴定在流行病学溯源、病原检测、生物学特性、致病性和疫苗毒株的研究中具有重要的作用。1951年南非分离的Spencer株是通过猪体内传代11次得到的，另外采用猪-兔交替接种也可以培育出ASFV的兔适应株。1960年，Malmquist等首次用猪骨髓细胞和血液白细胞成功分离到ASFV，随后该技术广泛应用于ASFV的分离。目前，用于ASFV分离的细胞分为原代细胞和传代细胞。

1.2红细胞吸附试验(HAD)

1960年，Malmquist在首先发现了病毒感染猪白细胞的培养物后出现了红细胞吸附的反应，从而建立了ASFV的HAD试验方法，后经过完善成为了ASFV的鉴定方法。ASFV的红细胞吸附能力通过抗血清阻断，且抗体的抑制作用只针对同源毒株，因此可以用来测定抗体的效价和鉴定抗原的差异。大多数ASFV的分离株具有HAD的活性，但也存在少数的毒株没有此活性，称为NHV（non-haemadsorbing virus）毒株，该类毒株大多数不具有致病性。1963年首先在西班牙发现NHV毒株，这些毒株能在白细胞培养中产生细胞病变，但没有HAD能力。对于该类毒株可用FAT或PCR进一步鉴定。HAD试验是OIE推荐的病毒鉴定方法之一，敏感度大约为92%，由于NHV株的存在，并不适用于所有ASFV的检测，试验时间需要3-10d，目前该方法逐渐被PCR方法所替代。

1.3荧光抗体试验（FAT）

1969年，Bool等首先建立了ASFV的FAT试验方法，该试验方法广泛应用于病毒抗原的检测。1985年，随着ASFV单抗的研制成功，利用荧光标记单抗用于分离病毒和组织的检测，特异性更高。FAT方法可用于白细胞培养物涂片进行抗原检测，也可以用于感染猪的淋巴结、脾、肾和肺等组织进行冰冻切片或压片，观察到细胞浆荧光判为病毒阳性。该试验是OIE推荐用于ASFV抗原鉴定的方法，不仅可用于NHV毒株的检测，还可用于其他致病CPE病毒的鉴别诊断。在急性病例的检测中，FAT方法敏感性高、快速、经济，可以在2h内获得结果，但在亚急性、慢性的病例的诊断中敏感性显著降低，原因可能是组织体内抗体与靶抗体形成复合物，阻断了靶抗原与荧光抗体的结合。

1.4病毒核酸检测

1.4.1普通PCR方法

PCR技术发明于上世纪80年代，利用特异性的引物，对样品中的核酸模板得到指数级别的扩增，使皮克（pg）水平的DNA扩增到微克（μg）水平，扩增产物通过染色得于用肉眼识别，大大提高了检出率。1992年，Steiger Y等根据保守基因设计了特异的引物用于ASFV的检测。进入21世纪，PCR技术得到了进一步的发展，检测的特异性和敏感性得到了进一步的提高。ASFV的PCR引物通常是根据B646L基因的高度保守区来设计的，引物的位置不同和碱基的组成不同，PCR的扩增效率也不同。OIE推荐的PCR方法是Aguero等2003年建立的，扩增片段大小为257bp，该方法用于检测不同区域，不同年代的22株ASFV毒株均为阳性，最早可以检出感染2d猪的血液样品为阳性。Basto等根据B646L基因设计了2对引物建立了ASFV巢式PCR方法，内引物扩增片段为243bp，外引物扩增片段为370bp，该方法不仅可以检测组织、血液样品和培养物，还可以检测昆虫软蜱体内所带的ASFV。2008年，Giammarioli等建立ASFV、CSFV、PCV-2、PRRS和PPV等5种病毒的多重PCR，用于上述5种病毒的鉴别诊断，其中ASFV的引物为OIE推荐的引物。PCR方法快速、灵敏已经广泛用于ASFV的实验室诊断，但由于PCR需要对扩增产物进行分析，需要开盖，容易造成交叉污染，容易造成假阳性，另外临床样品中可能存在的酶抑制剂扩增不出造成假阴性。

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