PCR入门知识

 特异性扩增曲线

六、对样本阳性的判定：（1）试剂本身的阴阳性对照成立。（2）样本有Ct值且有特异性扩增曲线。

 注：在缺省设置的情况下，样本有Ct值但没有特异性扩增曲线，则手动调整阈值线按照阴性样本对待。

随着科技日新月异的发展，市场上出现了形形色色的成品试剂盒，诸如qPCR、ELISA、生物芯片、生化、化学发光等等。涵盖了医疗、食品安全及畜牧等诸多行业。在给实验人员带来极大便利的同时，大大降低了检测实验对人员要求的准入门槛。

前两章节以畜牧行业中的qPCR商品化试剂盒为例，简单的介绍了一下PCR反应的基础理论和基础操作。

本章节介绍实际操作中可能出现的问题，通过分析问题产生的原因来巩固前两章节的内容。

阴性对照（或样本）出现Ct值？阴性对照或者样本在扩增反应结束后出现Ct值（在没有受到污染的前提下不会出现特异性扩增曲线），需要手动调节阈值线并重新分析。详情见PCR入门之二-基础理论的对样本阳性的判定。

阳性对照未出现Ct值（特异性扩增曲线）？可能的原因：添加模板时，在PCR反应液的液面之上贴壁添加。由于进行扩增反应时首先会有一高温变性的过程，模板的添加量普遍体积较小，有可能在起始的预变性阶段被高温蒸发。详情见PCR入门之一-基础操作的5.加液的顺序和注意事项。

检测抗凝全血样本时，无法检测出阳性样本？可能的原因：错误的使用绿色帽（肝素）采血管收集抗凝全血。肝素对Taq 酶具有强抑制的特性，会抑制PCR反应的进行。详情见PCR入门之一-基础操作的2.抗凝采血管的选择。

阳性对照Ct值不稳定？针对qPCR试剂盒来说阳性对照的Ct值理论上为一定值（实际上略有小波动），如果近期的几次实验（最好是同一天）Ct值波动比较大，则可能的原因：1.移液器枪头安装不规范，漏气。造成取液量不准。2.排液后未合理的润洗枪头，造成实际排液量不均一。3.加入模板后未充分震荡混匀（轻弹PCR反应管底部几次也可）。4.PCR反应管上机扩增前未经离心，反应液未集中在反应管的底部。即往PCR反应液中添加模板需注意的四个细节操作：1）.规范安装移液器枪头。PCR入门之一-基础操作的4.移液器枪头的安装。2）.添加模板后正确的润洗枪头。PCR入门之一-基础操作的5.加液的顺序和注意事项。3）. 加入模板后充分震荡混匀或者轻弹PCR反应管底部几次。4）. PCR反应管上机扩增前掌上离心机离心，将反应液集中在反应管的底部，无气泡。

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