我国家禽H7N9和H9N2亚型流感流行病学调查

时间：2018-12-05 点击：次来源：南京农业大学动物医学院作者：陆勤勤等 - 小 + 大

禽流感（Avian influenza，AI）是由流感病毒引起的禽类传染病。近年来，H9N2 亚型和 H7N9 亚型流感病毒在我国家禽中引起较为严重的疫情， H7N9 亚型病毒在我国还引起较多的人间感染病例。为有效了解 H9N2 亚型和 H7N9 亚型流感的流行态势、疫情风险以及病毒变异情况，2018 年 3—5 月，在上海、江苏等 11 个省市，开展了 H9N2 和 H7N9 亚型流感流行病学调查。

1　材料与方法

1.1 主要试剂与耗材 QIAxtractor高通量核酸提取仪配套相关试剂、 QIAxcel Advanced 全自动毛细管电泳分析仪配套试剂：购自 QIAgen 公司；HiScript II One Step RTPCR Kit：购自 Vazyme 公司；植绒拭子：购自深圳麦瑞科林科技有限公司。

1.2　样品采集

2018 年 3—5 月，在上海、江苏、湖北、江西、广东、广西、云南、贵州、西藏、宁夏、黑龙江等11 个省份，随机选择 17 个活禽批发市场、37 个活禽零售市场、11 个养禽场、1 个散养户、1 个屠宰场，共 67 个场点，随机采集 4 792 份样品（每份样品含 1 只禽的咽肛双拭子样品），其中鸡 3 736 份、鸭 703 份、鹅 131 份、鸽 222 份，置于加有抗生素（259 mg/L 庆大霉素、60 mg/L 左旋氧氟沙星、60 mg/L 阿奇霉素）的 PBS- 甘油采样液中（pH7.2~7.6）保存，在 4 ℃下运输和保存。

1.3　RNA 提取

将采集的样品 10 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用 QIAxtractor 高通量核酸提取工作站提取病毒 RNA，−70 ℃保存备用。

1.4　HA 和 NA 基因扩增

按农业行业标准（NY/T772-2013），用 HiScriptII One Step RT-PCR Kit，对流感病毒血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）基因进行 RT-PCR 检测。引物序列见表 1。

RT-PCR 扩增反应体系为 25 μL，包括 2×RT-PCRBuffer 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1.0 μL，Enzyme Mix 1.25 μL、ddH2O 6.25 μL、RNA 模板3.0 μL。RT-PCR 反应条件为：50 ℃反转录 30 min，94 ℃预变性 5 min，然后进行 35 个循环（94 ℃变性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min），最后 72 ℃延伸 7 min。按照 QIAxcel 全自动毛细管电泳仪操作步骤，将 RT-PCR 的产物进行电泳检测，将阳性样品送至青岛睿博兴科生物技术公司测序。

1.5　序列分析

利用 MAGE 5.0 软件中的 Clustal W 方法，将本试验中检测到的病毒 HA 基因序列与参考株基因序列进行比对，再选择部分序列进行谱系分析。谱系分析的参数设置如下：采用Neighbor-joining计算方法，核苷酸变异设为 Kimura 2-parameter 模式，各位点变异速率设为 Gamma 分布（α=1.0）。Bootstrap 值的计算设置为 1 000 个重复。

1.6　显著性检验

对本次调查的阳性率，按照卡方检验进行显著性分析，P<0.05 判为差异显著。

2　结果与分析

2.1　H7N9 病毒检测

在 4 792 份样品中，未检出 H7N9 亚型病毒。

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