非洲猪瘟防控综述

3.4.2　分子生物学检测方法

3.4.2.1　PCR

PCR具有简单快速、灵敏度高和特异性强的优点, 是目前ASFV最常用的实验室检测方法。Aguero等(2003) 和曾少灵等 (2009) 先后根据ASFV VP72基因设计引物, 建立了ASFV的PCR检测方法, 均具有良好的敏感性和特异性, 可以检测出极低含量的ASFV, 为ASFV早期感染的快速诊断提供了有效的分子生物学检测方法。Aguero等 (2004) 和张倩 (2010) 先后建立了一步法多重RT-PCR方法, 能够鉴别诊断猪瘟病毒 (Classical Swine Fever Virus, CSFV) 和ASFV, 可以从临床样品 (如抗凝全血、细胞培养物和组织) 中检测到病毒, 这为早期快速、特异性诊断非洲猪瘟和猪瘟提供了可靠的方法。Basto等 (2006) 建立了检测蜱ASFV的套式PCR方法, 敏感性高于OIE推荐的PCR检测方法。Giammarioli等 (2008) 建立了检测CSFV、ASFV、猪圆环病毒2型 (PCV2) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 和猪细小病毒 (PPV) 5种病毒的多重PCR检测方法, 可以用于这5种病毒感染的鉴别诊断。崔尚金等 (2012) 建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法, 该方法采用纳米金颗粒作为热导介子, 提高了PCR反应效率。敏感性试验表明, 纳米PCR是常规PCR检测技术敏感性的1, 000倍以上, 最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。采用该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份临床送检的69份样品进行检测, 结果均为阴性, 表明该地区均无ASFV感染情况。

3.4.2.2 　荧光定量PCR

实时荧光定量PCR比常规PCR具有更高的敏感性和特异性, 可同时快速检测大批量样品。King等 (2003) 、李维彬等 (2007) 、张泉等 (2007) 、黄萍等(2010) 、Tignon等 (2011) 、李洪利等 (2012) 先后根据ASFV VP72基因, 曾少灵等(2010) 根据VP73基因, 董志珍等 (2009) 根据P54基因各自设计引物和探针, 建立了Taq Man实时荧光定量PCR方法。Mc Killen等 (2007) 建立的实时荧光定量PCR分子信标 (molecular beacon) 技术具有快速、特异性强、灵敏性和准确性高的特点。该检测方法可快速鉴别PRV、ASFV、PCV2和PPV。郭少平等(2010) 根据ASFV K205R基因序列设计合成引物及Taq Man探针, 建立了基于K205R基因的ASFV实时荧光定量PCR检测方法。Mc Killen等 (2010) 根据9GL基因建立了MGB探针实时荧光定量PCR检测方法, 最低可以检测到20拷贝标准DNA。该方法检测临床样品中的ASFV, 敏感性与OIE推荐Taq Man荧光定量PCR方法相当。Fernandez等 (2013) 利用通用探针库建立了ASFV的实时荧光定量PCR方法。陈静静等(2012) 建立了双重荧光定量PCR, 可同时检测CSFV和ASFV, 只需一步即可完成, 可作为鉴别两种病毒的诊断方法。王建华等 (2016) 根据ASFV CP530R基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 (HP-PRRSV) NSP2基因为靶序列, 分别设计特异性引物和Taq Man-MGB探针, 建立了一种可同时鉴别检测ASFV和HP-PRRSV的二重荧光定量RT-PCR方法。

3.4.2.3　重组酶聚合酶扩增 (RPA) 技术

RPA是一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术, 该方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠, 王建昌等 (2016) 基于ASFV VP72基因保守序列设计并合成引物, 建立了ASFV RPA等温检测方法, 为ASFV的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

3.4.2.4　线性指数聚合酶链式反应 (LATE-PCR) 技术

LATE-PCR是不对称PCR的一种形式, 该方法用于检测组织样品的病毒, 其敏感性可以达到大约1拷贝的病毒DNA。Ronish等 (2011) 基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法, 为ASFV的实验室诊断提供了敏感的检测方法。

3.4.2.5　环介导恒温扩增 (LAMP) 技术

LAMP技术操作简单、灵敏、快速, 检测成本远低于荧光定量PCR, 且不需要特殊仪器设备, 具有较高的临床实用性。江彦增等 (2009) 、王彩霞等 (2010) 、杨吉飞等 (2011) 先后根据ASFV VP72基因序列设计引物, 建立了快速检测ASFV的LAMP方法, 最低检测限可达10拷贝质粒DNA, 且具有良好的特异性。邬旭龙 (2014) 根据ASFV K205R基因序列设计引物, 建立了LAMP检测方法。LAMP方法不需要PCR中的变性、退火步骤即可进行靶序列的循环扩增, 不但大大缩短了时间, 且使反应能够在恒温条件下进行, 无需特殊仪器设备, 肉眼判读, 可以满足基层快速诊断的需要, 非常适合于基层兽医实验室和养殖场使用。

3.4.2.6　探针杂交技术

张鑫宇等 (2011) 针对ASFV VP72基因分别设计合成1条与保守区域互补的5’生物素标记及3’烷巯基修饰短链寡核苷酸探针, 并将烷巯基修饰的探针吸附到纳米金颗粒上, 制备纳米金标记探针, 将PCR扩增产物与生物素探针及纳米金标记探针进行杂交, 杂交产物加入吸附链霉亲和素的酶标板, 利用亲和原理, 捕获杂交产物, 银染增强法对纳米金标记探针进行信号放大, 进而建立了检测ASFV VP72基因的纳米金探针杂交方法。探针杂交技术检测灵敏度高, 能有效排除PCR检测过程中的非特异性结果, 省去了琼脂糖凝胶电泳步骤, 操作简便、检测迅速, 在酶标板中可批量反应, 为ASFV核酸检测方法开辟了新的途径, 但该方法的建立难度较高、操作较繁琐, 对试验人员技术水平要求较高。

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