一株养殖场乌鸡源H7N9流感HA基因的序列分析

摘要：H7N9流感的宿主主要是鸡，本研究对1株养殖场乌鸡源H7N9流感HA基因的序列进行测定，分析其分子特征，发现该毒株与当地流行的毒株核苷酸相似性较高，达98.7%,说明本次养殖场的乌鸡感染事件由本地区流行毒株引起。该病毒HA蛋白潜在的糖基化位点与其他参考毒株一致，均为5个，分别位于30～32、46～48、249～251、421～423、493～495位氨基酸。裂解位点为PEIPKG/RGLF，呈弱毒的分子特征。受体结合位点中，235位Q（H3编码226位），仍保持禽源与α-2,3受体结合的特征，但195位（H3编码186位）与169（H3编码160位）位均出现了适应人与α-2,6Gal受体结合的特征。本文为H7N9病毒感染不同宿主后的分子特征的研究提供有益的补充。

H7N9流感自2013年在华东地区出现已来, 已在多个省市流行，并造成了1000余人的感染，严重危害公共卫生安全和家禽产业的发展。随着H7N9的流行,其宿主范围也在不断扩大，当前已确认的易感禽类有鸡、鸭、鹅、鸽、麻雀和鹌鹑等，为适应不同的宿主，病毒在分子水平上也会相应的发生不同的变异。2016年12月广东某供澳乌鸡（竹丝鸡）场发生了感染，本文旨在通过对该宿主来源病毒HA基因的序列测定与分析，为该病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品：拭子样品1份，采集于供澳乌鸡场，该场禽群均无临床表现。

1.1.2试剂：抽提试剂RNAiso Reagent、一步法RT-PCR扩增试剂（PrimeScript™ One Step RT-PCR Kit ），购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 HA基因的扩增引物：上游引物P1：5`- cgagtgagcaaaagcaggggatacaa-3`；下游引物P2：5`- ccctctccctgtgcattctggtgtct-3`，P3: 5`-aagcagggatacaaaatgaac-3`；下游引物P4：5`- ccctccactatgatagcagtcc-3`，上海立菲生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取：按抽提试剂操作说明书进行。

1.2.2  HA基因扩增体系与程序：上、下游引物(25μM)各1μL、2×Bμffer 25μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL 、DEPC水11μL和所提取的病毒RNA 10μL，体系共50μL，反应程序为50℃ 30min，95℃ 2min，然后95℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 2min，30个循环，72℃延伸8min。

1.2.3 序列测定和分析

将PCR产物送上海立菲生物工程有限公司进行测序，结果用DNAstar软件进行序列拼接。并与下载自GenBank 的11株不同时期的H7N9 亚型禽流感病毒HA基因组序列进行比较, 采用MEGA 5.0软件绘制其HA因组的系统进化树。

2  结果与分析

2.1 HA 基因扩增结果：

扩增出大小分别为901bp和979bp的特异性条带，与设计预期相符，见图1。

图1  PCR扩增结果

M、DNA Marker DL2000；1-2、P1P2扩增结果；3、P3P4扩增结果

首页前一页123后一页尾页