非洲猪瘟分子病原学及分子流行病学研究进展

3.4 实验室诊断

从实验方法上分, 非洲猪瘟的实验室诊断主要有酶联免疫吸附试验 (ELISA) 、PCR、荧光定量PCR、DNA原位杂交、免疫组织化学检测、病毒分离、动物接种等多种方法, 另外, 一些新的方法正在被开发和评估, 比如检测抗原的侧流实验, 胶体金免疫层析试纸条, 检测抗体的免疫化学发光实验等等。但到目前为止, 生产实际中, 应用较多的还是Elisa、PCR以及荧光定量PCR等常用方法, 现将这几种方法进行简单介绍。

酶联免疫吸附试验 (ELISA) , 即利用抗原抗体进行免疫反应的定性和定量检测, 其已被广泛应用于生物医学领域。一般情况下, 非洲猪瘟病毒进入猪体内, 7d后便可诱导产生较高的Ig G抗体, 当然针对不同蛋白也会出现个别差异, 但不管怎样, 该方法仍是最为快速、方便的方法。当前, 市面上尚未使用非洲猪瘟相关疫苗, 因此只要抗体检测阳性, 便可确诊为非洲猪瘟病毒感染。刘丰等人便利用法国ID VET公司的非洲猪瘟抗体检测试剂盒对对黑龙江省18个边境县开展了非洲猪瘟的流行病学调查, 结果均为阴性。但非洲猪瘟引起的急性病例中需结合其它检测方法进行确诊, 因为机体可能尚未产生抗体便已死亡。

PCR, 聚合酶链式反应, 是体外扩增基因的一种方法。研究表明, 非洲猪瘟感染8h, 便可从血液中检测到其核酸物质, 因此, 针对非洲猪瘟病毒保守区域设计引物, 对采集的血液或组织病料等相关物质进行DNA提取, 进行PCR反应, 可对其进行快速准确诊断。荧光定量PCR, 通俗讲是PCR的升级版, 其更加敏感、准确。

3.4.1、 血清学检测方法

3.4.1.1 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

ELISA应用于血清抗体的检测, 具有操作方便、特异性较好、灵敏度高的特点, 适用于大批量样品的检测, OIE将ELISA作为诊断ASF的首选血清学方法。ASFV含有约150种蛋白, 目前国内外常用作检测抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等。Wardly等[1] (1979) 首次建立了间接ELISA方法检测ASFV抗体, 具有较好的敏感性和特异性。Pastor等[2] (1990) 分别以ASFV主要结构蛋白VP73和病毒感染的细胞培养物中高特异胞质可溶性抗原 (CS-P) 建立了两种间接ELISA方法, 两种方法特异性均较高, 但是CS-P抗原比VP73抗原至少能提前2d检测出ASFV抗体。Vidal等[3] (1997) 用VP73单抗建立的固相ELISA, 能够检测到浓度为0.5μg/m L的VP73抗原和2.3×102pfu/m L的全病毒颗粒。Hutchings等[4] (2006) 比较了用全病毒多抗血清和针对VP73蛋白的单抗进行间接夹心ELISA检测ASFV, 显示多抗血清的敏感性高于单抗。Perez等[5] (2006) 以昆虫细胞表达的P30重组蛋白为包被抗原, 建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法, 敏感性高, 可用于ASFV特异性抗体的早期检测。Gallardo等[6] (2009) 利用重组蛋白p K205R、p B602L、p104R和P54建立的ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性。蒋正军等[7] (2000) 以杆状病毒表达的ASFV VP72蛋白为抗原, 研究和组装了间接ELISA抗体检测试剂盒, 具有反应体系小、快速、特异等优点, 且比Dot-ELISA方法更加敏感。仇华磊[8] (2006) 采用大肠杆菌表达的GST-VP72融合蛋白为包被抗原, 建立了间接ELISA。朱红[9] (2007) 成功获得5株分泌抗ASFV VP72蛋白单克隆抗体的细胞株, 也建立了间接ELISA方法。李秋霞[10] (2010) 以大肠杆菌表达的ASFV p ET32a-VP73L重组蛋白作为包被原, 也建立了间接ELISA方法。曾少灵等[11] (2013) 利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达的ASFV的VP73重组蛋白作为检测抗原, 建立了间接ELISA方法。靳雯雯[12] (2014) 以VP73纯化蛋白作为包被抗原, 建立了间接ELISA方法, 与商品化的阻断ELISA相比, 其具有较好的敏感性和特异性。董志珍等[13] (2012) 针对ASFV P54蛋白建立了单克隆抗体竞争法ELISA并构建了检测试剂盒, 灵敏度高于间接免疫荧光 (IFA) 方法。梁云浩等[14] (2014) 利用Bac-toBac杆状病毒表达系统表达出的ASFV P54重组蛋白作为检测抗原建立了间接ELISA方法。邬旭龙等[15] (2016) 以原核表达的ASFV p K205R蛋白作为包被抗原, 建立了间接ELISA检测方法。张倩等[16] (2012) 采用瑞典Svanova ASFV间接ELISA抗体检测试剂盒对辽宁绥靖、内蒙古赤峰、大连东港共计92份猪血清进行了ASFV抗体的检测, 结果全部为阴性。邓飞等[17] (2016) 采用西班牙Ingenasa ASFV阻断ELISA抗体检测试剂盒对来源于四川省内的92份猪血清进行检测, 结果表明, 92份血清样本均为ASFV抗体阴性。

3.4.1.2 胶体金免疫层析 (GICA) 试纸条

张鑫宇等[18] (2014) 用原核表达的ASFV P54重组蛋白制备了ASFV抗体快速检测胶体金试纸条, 通过对ASFV不同感染时期141份猪血清样品进行比对检测, 显示该试纸条在感染早期的符合率高于OIE推荐的ELISA检测方法。刘波[19] (2014) 也运用原核表达系统和胶体金免疫层析技术, 对ASFV快速检测试纸条的技术进行了研究。吴海涛[20] (2015) 运用双抗体夹心法原理纯化后的抗ASFV单克隆抗体制备金标抗体, 制备了用于检测ASFV的胶体金免疫层析试纸条。

3.4.1.3 其他血清学方法

荧光抗体试验 (FAT) 可用于检测野外可疑猪或实验室接种猪的脾、淋巴结等组织压片和冰冻切片中的ASFV抗原。该方法具有快速、经济、敏感性和特异性高等优点, 但需要专业试验人员, 同时需要荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。因此仅作为ASFV的辅助检测方法。间接免疫荧光试验 (IFA) 可用于检测感染ASFV的猪血清样品。该方法的优点是当ELISA检测结果不确定或制备抗原困难或复杂时, 可选用此法。

首页前一页12345678910后一页尾页