2015—2017年我国猪繁殖与呼吸综合征流行毒株遗传变异分析

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductiveand respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus，PRRSV）引起的一种高度接触性传染病，临床上主要以各年龄猪的呼吸道症状和妊娠母猪晚期流产、早产，产弱仔、死胎或木乃伊胎为特征。我国 PRRS 疫情于 1995年底首先发生在华北地区的规模化猪场，继而短时间内迅速传遍全国。自 2006 年以来，我国又出现了高致病性 PRRSV，并对我国养猪业造成了巨大经济损失。

GP5 是 PRRSV 的主要结构蛋白之一，属于病毒的囊膜糖蛋白，能够诱导产生具有保护作用的中和抗体，并在病毒诱导细胞凋亡和识别细胞表面受体等方面发挥着极其重要的生物学功能。美洲型和欧洲型毒株的 GP5 蛋白分别为 200 和 201 个氨基酸，含有 2~4 个糖基化位点和一段 31 个氨基酸的信号肽。GP5 蛋白具有较好的免疫原性，且其诱导的中和抗体出现之后，抗血清主要识别 GP5 蛋白。有研究表明，抗 GP5 抗体的效价跟血清对病毒的中和作用呈正相关。本研究通过对 2015—2017年所分离的 PRRSV GP5 基因序列进行分析，为当前 PRRS 防疫及研究提供一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1 病毒样品

2015—2017 年全国 15 省 份 58 株 PRRSV 感染的临床样品。

1.2　主要试剂

RNA 提取试剂盒：购于 TAKARA 公司；高保真反转录（RT）试剂盒：购于罗氏公司；LATaqDNA 聚合酶：购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.3　检测与测序

按照文献介绍的 RT-PCR 方法进行检测。利用病毒 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，用 RT 试剂盒进行反转录反应。ORF5 引物为：上游：CATTTCATACACCTGAGACCAT；下游：AGATCATATATCATCACTGGCT。

反应条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃15 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共 32 个循环，68 ℃延长 10 min；15 g/L 凝胶电泳，150 V，25 min。将RT-PCR 产物送大连宝生物公司进行测序。

1.4　分子进化分析

利用序列分析软件 DNA star Lasergene，对所选毒株 ORF5 基因进行序列比对，分析其同源性，利用 MEGA6 软件制作进化树。

2　结果与分析

2.1　RT-PCR 检测

对所检测样品 GP5 基因进行 RT-PCR 检测，检测到773 bp的目的条带，表明所检样品均为PRRSV（图1）。

1~3. 阳性样品；4. 阴性对照；M. DNA 标准 DL 2000

图 1 RT-PCR 检测结果

对 58 株野毒株 GP5 基因进行序列分析发现，以 VR2332 MLV 为代表的第一亚群有 6 株，以TJ2006/JXA12006/HUN42008 为代表的第四亚群 35株，以 NADC30 为代表的第五亚群 11 株，新亚群6 株，没有分离到以 CH1R/CH1A 为代表的第二亚群，以及以HB1/HB2为代表的第三亚群毒株（图2）。

2.3　分离毒株与标准毒株间核苷酸及氨基酸同源性分析

将分离的野毒株核苷酸与标准毒株核苷酸，通过 DNASTAR 进行同源性对比发现：与第一亚群在同一分支的 6 株野毒株与第一亚群同源性 为 93.7%~99.3%，与其他亚群同源性为83.1%~91.4%；与第四亚群在同一分支的 35 株野毒株与第四亚群同源性 为 94.9%~99.7%， 与其他亚群同源性为 83.3%~94.4%； 与 NADC30为代表的第五亚群在同一分支的 11 株野毒与第五亚群同源性为 94.2%~99.7%，与其他亚群同源性为 82.3%~90.2%；6 株新亚群之间的同源性为 93.7%~99.2%，与其他亚群同源性为82.1%~85.6%。

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