广西边境地区活禽批发市场禽流感流行病学监测

广西与越南毗邻，陆地边境线长 1 020 km，海岸边境线长 1 595 km。由于缺乏天然屏障，中越边境贸易与民间来往非常频繁，动物及动物产品非法交易较为普遍，由此给双边的动物疫病控制带来严重挑战。活禽批发市场是禽类的集聚地和周转地，活禽来源十分复杂，其携带的病毒可随禽类流动大范围散播，因此活禽市场是禽流感等家禽疫病监测的重点区域。作为广西中越边境重大动物疫病防控阻截带建设的内容之一，从 2012 年 12 月开始，对广西边境地区的主要活禽批发市场进行了系统的禽流感监测和调查。

1　材料与方法

1.1 材料

H1—H16 亚型禽流感标准阳性血清：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；RNA 提取试剂盒 TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA ExtractionKitVer.5.0：购自大连宝生物工程有限公司；禽流感病毒 H1~H16亚型核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）：购自上海之江生物科技股份有限公司；SPF 鸡胚：购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2　方法

1.2.1　采样地点　广西 9 个边境县（市、区）的10 个活禽批发市场。

1.2.2　采样方法　2012 年 12 月—2017 年 12 月，以检测或发现疾病为目的，采取“靶向抽样 + 主观抽样”的混合抽样方式，在每个活禽批发市场，每次采集约 100 份家禽拭子（水禽 80 份、鸡 20 份）和 20 份环境拭子。每季度 1 次。

1.2.3　流行病学调查　在采集样品的同时，收集市场基本信息，包括样品来源、家禽流通情况以及生物安全管理状况等数据。

1.2.4　病毒分离和鉴定　该部分试验在哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室进行。取拭子样品处理液，按文献方法，尿囊腔接种 10 日龄 SPF鸡胚（每个样品接种 2 枚），37 ℃孵育，每天观察2 次；弃去 24 h 内死亡的鸡胚，及时收集 24 h 之后死亡的鸡胚；至 96 h，将所有鸡胚置于 4 ℃过夜；收集鸡胚尿囊液，用血凝试验（HA）测定其HA效价；对有HA测定效价的鸡胚尿囊液，先用 H1—H16 亚型禽流感标准阳性血清进行血凝抑制试验（HI），初步鉴定尿囊液中所含的禽流感病毒亚型；再用相应的禽流感亚型鉴定核酸检测试剂盒进行荧光 RTPCR试验，验证尿囊液中所含亚型禽流感病毒种类。HA 和 HI 试验按照国家标准 GB/ Ｔ 18936—2003的要求进行操作；H1—H16 亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 试验按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5　统计分析　用 Microsoft excel 软件，统计分析样品的病毒分离及亚型鉴定结果。

2　结果与分析

2.1 禽流感监测情况

2.1.1　病毒分离　2012 年 12 月—2017 年 12 月，在 9 个边境县的 10 个活禽批发市场，共采集样品20 次，采集样品 14 075 份，分离到禽流感病毒 2245 株，病毒总分离率为 15.95%；分离到的流感病毒亚型有H1、H3、H4、H6、H7、H9、H10和 H11等，其中以H3、H6和H9亚型最多（表 1）。

2.1.2　时间分布　按公历气象划分法，一般 1月份为最冷月，7 月份为最热月；3—5 月为春季，6—8 月为夏季，9—11 月为秋季，12 月—2 月（来年）为冬季。监测结果显示：广西边境地区活禽批发市场一年四季都有 A 型禽流感病毒循环；冬季检测样品 5 458 份，分离到病毒 962 株，病毒分离率为17.63%（962/5 458）；春季检测样品 2 020 份，分离出病毒 330 株，病毒分离率为16.34 %（330/2 020）；夏季检测样品 1 722 份，分离到病毒 239 株，病毒分离率为 13.88 %（239/1 722）；秋季检测样品 4 875 份，分离到病毒 714 株，病毒分离率为14.65 %（714/4 875）。具体结果详见表 2。

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