大肠杆菌的常规分离鉴定方法

在兽医临诊或实验中，需做分离鉴定的大肠杆菌多限于一些对畜禽有致病性的菌株，如引起初生幼畜(仔猪、犊牛、羔羊)兼或断奶猪腹泻的ETEC菌株、致猪水肿病和幼兔腹泻以及鸡各种大肠杆菌感染症的病原性菌株。除对分离菌做生物化学分型鉴定和血清学分型鉴定外，还应包括对ETEC黏附素抗原和肠毒素的鉴定，对水肿病菌株的SLT-Ⅱ有条件时也可以进行测定。至于对鸡、兔和猪水肿病的菌株的菌毛鉴定且前尚处于实验室研究阶段。

1.形态和培养特征

致水肿病和新生仔猪腹泻的大多数菌株可呈溶血，在麦康凯琼脂上形成红色菌落，伊红美蓝琼脂上为中心暗蓝黑色并有绿色金属闪光的菌落。

2.生化鉴定

凡被检菌落的细菌在三糖铁琼脂(TST)的反应为阳性者，在O抗原鉴定为阳性或与此同时进行常规生化项目鉴定亦符合埃希菌属的生化特性后，方可继续作进一步血清学定型和毒性因子测定。

已知有97％分离出的大肠杆菌产生葡萄糖苷酸酶，此酶能使葡萄糖苷酸-4-甲基伞形花烯(MUG)分解而生成荧光性甲基伞形花酮，可用作快速检测。Thompson(1990)的快速法可于2Omin内完成。将应试大肠杆菌培养于哥伦比亚琼脂基础(Oxoid，含5％的绵羊血)，在36℃孵育18-24h。

MUG试剂：4-甲基伞形花烯寸-D葡萄糖苷酸1OOmg，蒸馏水1OOml，三通(TritoxX-1OO)2滴，待完全溶化，用O．45tzm孑L径滤膜行滤过灭菌，储于无菌玻瓶内，在冰箱中可保存6月。在冰箱中溶液清澄，在室温中微浊。

试验：用6mmX 5Omm试管作培养。滴2-3滴(约0．5m1)MUG试剂于试管中，加热到室温，用一无菌接种棒刮下一部分纯培养物在MUG试剂中乳化，使呈乳样悬剂。在44．5℃水浴中孵育2Omin，此温度可产生最强反应；但在22～44．5℃之间均可有满意的反应。次用高强度长波长(366nm)紫外线灯在暗室内检视，置试管于光源下15cm处，易于观察。阳性者发出青色荧光。

同样原理，葡萄糖苷酸亦可和其他各种产荧光性试剂结合，供检测葡萄糖苷酶酸酶。

3.血清型鉴定

大肠杆菌目前有164个O抗原(O1～O171)、72个K抗原(K1～K1O3)和55个H抗原(H1～H57)，已发现的血清型至少有几千种。因此，该菌的血清型鉴定是以O抗原、K抗原、H抗原三种抗原作为基础的，对ETEC菌株还必须增做黏附素抗原的鉴定。鉴于ETEC和EPEC均常局限于少数O抗原群，且前者的O抗原群又与黏附素及肠毒素之间存在一定的相关性。

因此通常对动物ETEC和猪水肿病及禽大肠杆菌病的菌株可先确定其O抗原型，然后做完全的血清型鉴定。鉴定O抗原的抗血清必须用单因子抗()血清，以免发生交叉反应。若使用非单因子血清应以试管凝集的反应结果来判定。

4.ETEC毒力因子的鉴定

和幼畜腹泻有关的大肠杆菌分离物在上述生化和血清型(至少是O抗原)鉴定证实为本菌后，再鉴定其是否具有黏附素抗原和肠毒素。对肠毒素的鉴定可根据黏附素与肠毒素关系选择适当的方法。通常，牛、羊源菌原只产ST，而猪源菌株多产LT和ST。鉴定黏附素的方法很多，一般实验室多用玻板凝集试验、荧光抗体技术、ELISA和MRHA及其抑制试验等方法。鉴定肠毒素的方法常用的为兔回肠结扎试验或仔猪小肠结扎试验、兔皮肤蓝斑试验以及平板免疫溶血试验等。对ST的动物试验只有乳鼠胃内投服试验可用。猪水肿病菌株的SLT-Ⅱ的鉴定目前仍以Vero细胞测定法为主。