四川某规模猪场O型口蹄疫抗体检测分析

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病，对我国猪、牛羊主要经济动物养殖的健康发展带来了严重威胁。我国目前采取以免疫为主的综合防控措施进行口蹄疫防控，免疫抗体检测是衡量疫苗免疫效果的重要指标。目前,国际粮农组织（FAO）和世界动物卫生组织推荐液相阻断ELISA来对口蹄疫免疫效果进行评价。硏究表明口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测技术具有良好的敏感性、快速诊断性和可重复性,与攻毒保护有很好的相关性,现被广泛应用于口蹄疫免疫抗体水平的监测。此方法专为检测FMD全病毒抗体设计，是针对完整病毒粒子的抗原位点进行抗体定性定量检测,通过对被检血清的倍比稀释,定量测定血清中抗体含量的高低,从而真实反映出免疫后机体抵御病毒侵入的能力。

为了保证出生至保育猪阶段的仔猪有较高的抗体水平。四川某规模化养殖场哺乳阶段14-28日龄和保育阶段35-45日龄仔猪，各采集血清100份。用ELISA检测方法进行O型免疫抗体水平检测。结果显示:某规模化养殖场14-28日龄仔猪、35-45日龄保育猪的O型免疫抗体平均合格率分别达85%和94%。

1 材料与方法

1.1实验器材

单道、12道移液器若干、96孔U型反应板若干、37℃恒温生化培养箱、100ml量筒、iMark-酶标仪。

1.2血清样品

四川某养殖场提供14-28日龄仔猪，35-45日龄保育猪血清各100份。该规模化养殖场口蹄疫疫苗的免疫程序为：（1）种猪一年普免四次（每季度1次）；(2)仔猪52日龄免疫1毫升，77日龄二次免疫2ml,120日龄第三次免疫2ml。

1.3所用试剂盒

口蹄疫O型液相阻断抗体检测试剂盒（20170602101-2）购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.4实验方法及判定标准

采用液相阻断ELISA测定实验动物血清中口蹄疫特异性抗体,具体方法如下：

1.4.1待检血清稀释按50ul每孔用PBST做1:16开始的2倍稀释至1:128，每孔加入50ul稀释至1:15的O型口蹄疫病毒灭活抗原，对照孔加100ul，振荡混匀，4℃过夜。

1.4.2过夜后，将抗原抗体板上的液体按每孔50ul转移到包被0型口蹄疫病毒兔抗的ELISA反应板上，37℃避光温育60min。

1.4.3弃去各孔中液体，甩干。每孔加满PBST清洗液,静置约30s,重复5次,拍干，每孔加入50ulO型口蹄疫病毒豚鼠抗体工作液,37℃避光温育30min。

1.4.4弃去各孔中液体，甩干。每孔加满PBST清洗液,静置约30s,重复5次,拍干，每孔加入50ulO型口蹄疫病毒兔抗豚鼠抗体酶结合物工作液,37℃避光温育30min。

1.4.5弃去各孔中液体，甩干。每孔加满PBST清洗液,静置约30s,重复5次,拍干，每孔加入50ul显色液（TMB底物A、B溶液按1:1混匀）,37℃避光温育15min。

1.4.6每孔加入50ul终止液，读取OD450nm值。

1.4.7结果判定:以抗原抗体对照平均OD450nm的50%为临界值,被检血清稀释孔OD450nm的值大于临界值，抗体滴度为＞1:128；小于或等于临界值，抗体滴度为﹤1:32；若临临界值处于两个滴度之间,应取中间值。

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