吸取用灭菌生理盐水适量稀释（通常做10-1-10-4稀释）的样品稀释液1ml，置灭菌平皿内，倾倒以灭菌溶化并冷却至50℃左右的培养基15-20ml，混匀，待其冷却后，倒置。于37℃恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。
4.3穿刺培养法：此法用于保存菌种，观察某些生化反应。以接种针挑取细菌培养物，插入固体培养基的中央穿刺至培养基2/3处，然后沿原穿刺线退回接种针。于37℃恒温培养箱中培养后观察反应情况。
5、染色方法
5.1制片：
a、涂片：取保存在酒精中的干净玻片，在酒精灯上烧去残留酒精，待凉，用记号笔在玻片的右侧，注明菌名、染色类型。用接种环在玻片中央滴加一小滴无菌生理盐水，以无菌操作取单个菌落，在玻片上均匀涂抹；或无菌操作法用接种环取菌液1-2环，均匀涂布载玻片中央。（注意菌落涂片以肉眼无明显可见菌块为宜，菌液尽量涂开）。
b、干燥：涂片放在室温下自然干燥，也可将标本放在酒精灯火焰上方约10-15cm处烘干，以助水分蒸发。
c、固定：将已干燥的涂片向上，在酒精灯外焰处迅速通过2-3次，以不烫手背为宜，使得菌体与玻片牢固结合。
5.2 革兰氏染色
a、初染：在已干燥固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液（以覆盖整个菌层为度），1min后，水洗，甩干。
b、媒染：滴加革兰碘液于抹片上，1min，水洗，甩干。
c、脱色：滴加95%乙醇脱色并轻轻晃动载玻片，直至洗出的乙醇不出现紫色时停止（约0.5min），水洗，甩干，滤纸吸干残存水滴。
d、复染：滴加沙黄复染液或石炭酸复红溶液，1min，水洗，滤纸吸干后，备镜检。
e、结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
二、操作方法：
1、无菌环境：打开超净台紫外灯开关，紫外灭菌30分钟，关闭紫外灯，再打开风机10分钟。再将待检病料、培养基等物品放入超净台内。
2、病料处理：对疑似感染细菌的病变组织器官，应先用刀片灼烧组织或渗出物，烫灼组织表面杂菌，在烧灼部位打开1cm左右的切口，然后再用接种环或消毒棉签通过灼烧过的表面插入组织内取样，取样后进行划线接种。
3、接种培养：根据样品中细菌的多少选择平板划线方法，接种后，将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养8-12小时。
4、结果观察：12小时后观察菌落形态，初步判断可能的疑似菌。再用接种环挑取单个菌落进行染色镜检观察。
染色镜检观察细菌形态是细菌分离试验的最后一关，要想鉴定细菌种类，各种常见细菌的分离培养方法、特性、形态的了解是前提。
三、常见细菌分离鉴定方法
（一）、沙门氏菌
1、分离培养：以无菌操作的方法直接用接种环醮取病变组织接种到亚硫酸铋琼脂、HE琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂培养基上，37℃恒温培养18-24 h，观察细菌生长情况及菌落特征。
2、形态学镜检：挑选亚硫酸铋琼脂 （BS）、SS琼脂、麦康凯琼脂或HE琼脂上可疑的单菌落抹片，进行革兰氏染色、显微镜观察。沙门氏菌是革兰氏阴性细长杆菌，中等大小（0.5μm×1-2.5μm)，两端钝圆，无芽孢和荚膜，有鞭毛，能运动，单个散在（见图示1）。
3、培养特性：
3.1 普通琼脂：鸡白痢、鸡伤寒菌型沙门氏菌生长贫瘠，菌落较小，直径约0.5mm。其他沙门氏菌生长良好，形成中等大小、圆形、边缘整齐、湿润、稍隆起、无色、半透明的菌落，直径约1.5mm。
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