(2)操作
①浇琼脂板和打孔 将已融化的琼脂趁热倒入平皿,制成3毫米厚的琼脂板,待凝固后进行打孔。一组共7个孔,中间l孔,周围6孔。用打孔器打孔,剔出孔内的琼脂,然后将琼脂板在酒精灯上来回过 2－3次,使琼脂与玻板之间的空隙封闭。
②向孔内加样 中央孔加抗原,外周孔第1,5孔加阳性和阴性血清作对照,第2,3,4,6孔加待检血清。将加完样的琼脂平皿合上盖子,置37℃恒温箱扩散24－36个小时,然后判定结果。
③结果判定 首先检查标准阳性血清孔和抗原孔之间是否出现明显的致密的白色沉淀线5的，而阴性孔则不出现,只有在对照组出现正确结果的前题下,被检孔才可参照标准判定。
④注意事项
第一,琼扩所用的琼脂必须是优质的琼脂粉,若用普通的琼脂条,应事先进行净化精制。精制的简易方法是：取条状琼脂24克,加蒸馏水1 000毫升,在沸水中融化,趁热倒入搪瓷盘中,待冷却后切成1平方厘米大小的琼脂块,用蒸馏水或无离子水浸泡2－3天,每天换水4－5次，然后将处理好的琼脂块隔水融化,加入0.1%石炭酸磷酸缓冲盐水,配成1%琼脂。
第二,制备琼脂板应在水平台上进行,防止产生厚薄不匀。板的厚度要求一致(7.5厘米的平皿,用15毫升琼脂液)。 浇制时防止产生气泡。平皿浇制的琼脂板在4℃冰箱内可保存15天。
第三,打孔的孔径、孔距力求准确、合适。
第四,加滴孔中的抗原和血清时,孔内必须加满而又不能外溢。加样时不能带进小气泡。
3.酶联免疫吸附试验(ELISA)
免疫酶技术是根据抗原与抗体特异性结合的功能,以酶作标记物,利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的,它既可用于抗原的诊断,也可进行血清抗体的检测。
本试验是通过化学方法将酶与抗体(或抗原)结合起来, 标记后的抗体(或抗原)仍然保持与相应抗原(或抗体)相结合的免疫学活性。例如,酶抗体与相应抗原结合后,形成酶标抗体-抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时,催化底物分解、氧化而生成有色物质,有色产物的出现,客观地反映了酶的存在,根据有色产物的有无及其浓度,即可间接推断被检抗原或抗体是否存在及其数量,达到定性和定量的目的。
免疫酶技术已经广泛地用于传染性疾病的诊断,血清流行病学调查和抗体水平的评价,微生物抗原的检测及其在感染细胞内的定位。
目前在兽医防治的研究和实践中,对于猪瘟、伪狂犬病、 繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病, 均采用免疫酶技术进行病原诊断，抗体检测和血清学流行病调查,并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。
利用免疫酶技术测定抗原或抗体的方法很多，下面仅简要介绍两种适合猪场使用的免疫酶技术。
(1) 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)
①材料 硝酸纤维滤膜(孔径0.45微米),0.01摩/升、 pH值7,2的磷酸盐缓冲盐水,封闭液(磷酸盐缓冲盐水加入 10%马血清或0.1%明胶),30%双氧水(H2O2),3,3′-二氨基联苯胺(DAB)抗原液,阴性对照,待检液,待检血清,阳性血清及阴性血清,酶标免抗猪免疫球蛋白G(IgG),0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液,洗涤液(磷酸盐缓冲盐水加入 0.05%吐温-20)。
②操作
检测抗原
1)硝酸纤维滤膜(NCM)的处理：在滤膜上划6毫米×6毫米的方格,在方格中央用蘸水笔尖的圆尾末端压成圆形痕迹。置于蒸馏水中浸泡10分钟,取出后晾干备用。
2)点样：取1微升待检液在硝酸纤维滤膜圆圈内点样,同时设立阳性与阴性对照,自然干燥或置37℃温箱中干燥。
3)封闭：将硝酸纤维滤膜置于封闭液中,37℃30分钟, 用洗涤液洗涤1次,约3分钟。
4)加工作浓度的猪阳性血清,将硝酸纤维滤膜置于猪阳性血清中,37℃作用1小时,取出用洗涤液洗涤3次,每次3 分钟。
5)加酶标兔抗猪免疫球蛋白G,37℃作用1小时,然后洗涤3-4次,每次3分钟。
6)加底物溶液(0.05摩/升三羟甲氨基甲烷-盐酸缓冲液 100毫升,加3,3′-二氨基联苯胺40毫克,30%双氧水50微升),作用5－20分钟。
7)终止显色,将硝酸纤维滤膜置于蒸馏水中冲洗2－3分钟
8)自然干燥,或37℃下干燥。
9)判定标准：
"一" 不呈现斑点,与阴性对照相同。
"+" 斑点较弱或点内有不均质的棕色点。
"++" 斑点浅棕色,对比度清晰。
"+++" 介于++和++++两者之间。
"++++" 斑点深棕色,背景白色。
出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的Dot- ELISA效价。
10)注意事项：试验中的点样抗原、血清及酶标抗体的稀释度应根据预备试验确定；试验中应使用不溶性供氢体,如 3,3′-二氨基联苯胺,4-氯-1-萘酚等,不能使用可溶性供氢体； 根据试验的目的要求,确定检测抗原或抗体；封闭液可使用异种动物血清、牛血清白蛋白(BSA)或明胶溶液等进行封闭,根据预备试验选择最佳封闭条件。
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