浅谈影响血凝抑制试验的因素

时间：2009-12-12 点击：次来源：阳光畜牧网作者：阳光畜牧网 - 小 + 大

    血凝抑制试验(HI)，常用于鉴定从禽类中分离到具有凝集红细胞特性的病毒以及检测疫苗免疫后或病毒感染后抗体水平的高低。由于特异性好、能进行大量样本的分析、节省试剂和易于操作等优点，对实际生产中禽流感病毒亚型鉴定、流感疫苗质量控制和抗体监测等方面有着广泛的应用。但是实际操作中HI试验受很多因素的影响。有些因素甚至能严重影响实验结果的准确性。笔者多年从事禽病的检测工作，现将多年来总结的经验及试验中遇到的问题结合一些研究资料，总结分析如下，以供同行参考。
    1影响血凝抑制试验的因素
    1.1抗原浓度对HI试验值的影响
    按照农业部的标准检测方法，检测用的抗原稀释为四个单位后还需做一次回归实验，即检测四个单位的抗原是否准确，但是生产中这一步经常被省略。事实上随着抗原浓度的增加，HI滴度逐渐下降，每增加1倍浓度，滴度下降0.9~1.1log2。
    1.2不同浓度的红血球对HI效价的影响
    选用0.25%、0.5%和1%三个浓度的红血球做比较试验，结果这3个浓度的红血球测得同一份血清HI滴度分别为7.74log2，8.7log2和9.6log2。即红细胞浓度从0.25%~0.5%、0.5%~0.1%，每增加一倍，血凝（HA）滴度平均下降0.7log2~1.5log2、HI滴度平均上升0.7log2~0.9log2。
    1.3温度对HI试验值的影响
    温度对HI试验值的影响比较大，呈正相关，从4℃~37℃，HI滴度平均上升2.3 log2，约每提高5℃平均上升0.35 log2。室温如低于4 ℃，红细胞会发生自凝。同时温度影响实验结果出现的快慢，一般37℃结果出现最快，随着温度的升高，会出现反应物解离和红细胞溶血现象。
    1.4抗原与抗体作用时间对HI试验值的影响
    HI滴度随作用时间的延长而升高，温度低，递增慢，达到HI最高值的所需时间长；温度高，递增快，达到最高值所需时间短。但在高温下，凝集图形洗脱加快，容易造成观察上的失误，一般在常温18℃~20℃，作用30分钟为标准。
    1.5稀释液PH值对HI试验值的影响
    用PH值为5.0~8.0的系列磷酸盐缓冲液，分别作HA和HI试验时的稀释液。有实验结果表明，稀释液PH值5.8以下时，红细胞会发生自凝；PH值7.8以上时，图形洗脱加快，易造成观察误差，以PH7.0时，红细胞沉降最充分，图形最清晰，HA值最小，HI值最大。
    1.6红细胞的来源对HI试验值的影响
    有的鸡红细胞有自凝现象，故标准采样应采4只鸡的血液混合，制成红细胞，减少自凝现象的干扰。要采非免疫鸡的血液，若是免疫过的鸡血，要充分洗去血清。
    1.7判定时间对HI试验值的影响
    加红细胞后，判定时间与抗原的洗脱快慢及反应温度有关。用浓缩抗原做HI试验，室温在15℃~37℃时，判定时间从15分钟~1小时，结果判定时间对HI试验值的影响很小，但需注意必须是浓缩抗原。如果用疫苗如新城疫弱毒苗做抗原，则影响较大，时间长了或短了都不行。
    1.8微量反应板处理的影响
    微量反应板V型孔内壁应光滑，不能用试管刷等来刷洗V型孔，使用过的反应板用硫酸与重铬酸钾配置的洗液浸泡或用3%的盐酸浸泡，冲洗后需过蒸馏水然后烘干。不洁净的反应板会造成红细胞的非特异性凝集，影响结果的判定。
    2常见问题的分析
    2.1抗原的问题
    由于禽流感病毒变异较快，所以在血凝抑制试验中经常会出现不同厂家生产的相同亚型的禽流感抗原所测同一血清的血凝抑制价不同，禽流感亚型病毒株按其血凝抑制实验所表现的亲和力不同而分为三种类型：对本株和异株免疫血清均呈较高效价的为“R”型、对本株效价高对异株效价低的为“P”型和对本株及异株均低的为“Q”型。由此可见养户使用一种疫苗免疫用另一厂家的抗原检测，这就是我们所说的“P”型，即抗原型的差异。如果在试验中出现型的差异所测结果会相差2~3个滴度，所以在血凝抑制试验操作时，挑选亲和型毒株作为测定抗原较好，这样会提高诊断的灵敏度。也就是说使用某一厂家的疫苗最好用此厂家提供的抗原做检测。
    2.2红细胞来源的问题
    在禽流感的HI中，会发现用鸡的红细胞悬液来检测鸡禽流感H5的HI抗体时，没有出现非特异性的凝集反应；而用鸡的红细胞悬液来检测鸭、鹅、鸽的禽流感H5的HI，特别是鸭、鹅非特异性的凝集反应明显。经查资料，禽血清中都有低的或无法检测到的非特异因子特别是水禽血清对鸡红细胞可能产生非特异性的凝集。若消除非特异性现象，对血清的处理非常麻烦，不适合在大生产中推广。经由一些试验证明，用鸡、鸭、鹅、鸽的红细胞悬液分别来检测鸡、鸭、鹅、鸽的禽流感H5的HI抗体时非特异凝集作用消除了。因此，在以HI试验检测家禽的禽流感抗体的试验中应使用同种非免疫家禽的红细胞悬液。
    总之，在生产实践中应认真细致，综合分析确保检测的准确性，以便有利指导生产。

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