家畜性别控制技术的研究进展

时间：2010-12-27 点击：次来源：互联网作者：阳光畜牧网 - 小 + 大

    2. 3 PCR扩增法
    20世纪初期,人们开始研究动物性别决定机制。20世纪50年代,发现了Y染色体能特异的决定睾丸组织的发育。在此后,人们对Y染色体上的睾丸决定因子(testis2determiningfactor,TDF)深入研究,并发现了SRY(sexdeter2miningregionoftheY)基因。PCR扩增法的实质是对性别决定有关基因(如SRY基因)的检测技术。该方法是对早期胚胎进行活组织取样,合成特异性引物,然后应用PCR技术对性别决定有关的基因进行检测,能扩增出目标条带的胚胎为雄性胚胎,否则为雌性胚胎。PCR扩增法进行性别鉴定技术是由活检(biopsy)、性别特异性序列及引物的选择、PCR扩增技术和活检后胚胎冷冻保存技术组成,因此该技术的发展不仅依靠PCR技术的发展。PCR扩增技术因有可靠的操作程序,具有高效、快速的特点,近年来得到迅速发展。该项技术也是目前唯一常规、最具商业价值的胚胎性别鉴定方法。
    1989年,澳大利亚首先成功地采用PCR扩增技术鉴定奶牛胚胎性别,准确率达90%以上(Cuus2ins,1991)。20世纪90年代中期,澳大利亚开始大规模商业化胚胎性别鉴定。Herr等(1991)利用PCR扩增技术,在体外扩增牛胚胎的SRY基因,鉴定了牛胚胎性别,结果表明准确率达92%。目前国外一些采用PCR技术进行牛胚胎性别鉴定的机构已进入商业化。
    该项技术在我国也迅速发展,尤其是牛的胚胎性别鉴定。1991年,上海市儿童医院医学遗传研究所和北京农学院合作,首次用PCR法扩增了牛胚胎的SRY特异序列,鉴定出了胚胎性别,经北京农学院胡明信、吴学清两位教授移植验证了降生小牛性别与鉴定结果完全相符(黄国清等,1998)。曾溢滔等(1993)通过对牛SRY基因片段的直接测序,设计了牛SRY序列的特异性扩增引物,对牛胚胎进行了性别鉴定并获得成功。
    由于该技术操作过程中胚胎经分割、冷冻和解冻等处理后仅有少量胚胎存活,导致胚胎移植成功率下降,而且劣质胚胎的性别鉴定成功率更低,这就制约了提供预知性别家畜胚胎的商业化进程。此后,为了尽量避免和克服这些缺陷人们做了很多研究。胡明信等(1995)参照小鼠SRY的DNA序列,直接测序测得了牛SRY序列,建立了PCR扩增牛SRY序列进行胚胎性别鉴定技术的方法。完善和提高了该项技术的实用性,同时对切割取样胚的移植技术,包括胚胎发育时期的划分、胚胎级别和胚龄的确定、胚龄与受体发情时间在移植中的关系、胚胎的切割取样、取样胚胎的冷冻效果以及冷冻方法等进行了研究,为该项技术应用于生产提供了有价值的参数。吕碧文等(1998)利用PCR技术扩增牛外周血淋巴细胞DNA中的SRY基因片段,对17枚早期胚胎进行性别鉴定,结果除1枚难以判断外,其他16枚判断正确,准确率达94.1%。黄淑桢等(2000)利用PCR技术鉴定试管羊胚胎性别,将124枚鉴定胚胎移植给44只受体母羊,结果分娩14只羔羊,流产2只,羔羊性别与胚胎性别的准确率达100%。在此基础上,人们又用改进了的PCR扩增技术进行胚胎性别鉴定。曹越等(2003)报道了通过全套式PCR扩增法对公、母牛静脉血及牛胚胎进行特异性条带鉴定。静脉血样与实际性别相符率为100%,显微切割下的5～8个胚胎细胞也出现与静脉血样相同的特异性条带,表明这种全套式PCR的鉴定方法准确、严谨、简便,具有很高的灵敏性和稳定性。陈从英等(2003)根据牛SRY基因调控区序列设计合成了2对巢式PCR引物作为公牛特异的性别鉴定引物,并根据牛酪蛋白基因序列设计合成了1对引物作为内标基因引物,建立了牛早期胚胎性别鉴定的PCR反应体系,鉴定了10枚奶牛胚胎的性别,结果表明,产下的犊牛实际性别和鉴定结果一致。吴阳升等(2004)对牛的雄性特异性片段和雌雄共有片段进行多重PCR扩增,扩增共进行43个循环,其中前11个循环为雄性特异扩增,后33个循环为雌雄共有片段扩增,其灵敏度可达到10pg级。在我国利用PCR扩增家畜SRY基因进行胚胎性别鉴定,其准确率达到98%以上,是目前为止最为理想的胚胎性别鉴定方法。由于胚胎细胞取样技术的限制,对胚胎造成一定的损伤,导致移植受胎率较低。我国鲜胚取样后的移植受胎率平均在25%左右,冻胚取样后的移植受胎率的实验室数据为21%～25%(魏雅萍,2003)。
    3、前景展望
    综上所述,关于X、Y精子分离技术和胚胎性别鉴定技术的研究,虽然已开展了一些工作并取得了一些进展,但很多问题有待解决,如流式细胞仪分离速度慢、仪器昂贵和部分精子类型不能被识别而影响其在生产中的应用,按照目前的分离速度,要获得一次输精剂量的牛精子,需花费近20h的时间,如此长的分离时间直接影响精子的活率,导致受胎率下降;再如PCR扩增法胚胎取样受实验员试验技术的影响、胚胎冷冻和解冻处理后对胚胎移植成功率的影响等。笔者认为,随着研究的不断深入,流式细胞仪也在不断更新换代,分离精子的速度必将逐渐提高,从流式细胞仪的发展速度看推广前景良好,同时结合体外受精和显微授精技术的研究,来提高精子的利用率,可以增加流式细胞仪的实际应用价值;PCR扩增法的整个操作可在几分钟内完成,在生产中应用非常方便,而且胚胎性别鉴定的PCR试剂盒已经出现,但在实际应用中成本问题是必须要考虑的,所以首先在大家畜和珍贵动物上应用的可能性较大。需要提出的是在完善和改进上述两种性控技术的过程中,可以寻找其他的方法回避技术中复杂的步骤。如日本荣研化学株式会社研制出Loopamp牛胚胎性别鉴定试剂盒,运用了新的基因扩增技术LAMP(loop2mediatedisotheralamplification)法,这种方法通过检测反应过程中获得的副产物焦磷酸镁所形成的白色沉淀的混浊度来判定结果,简化了PCR扩增结果的检测方法。
    家畜性别控制的研究是家畜繁育的一项重要课题,具有很大的理论意义和实际应用价值。通过X、Y精子的分离和胚胎性别鉴定可以有效地进行家畜性别的控制。家畜性别控制技术将成为家畜繁育的一项常规技术,对各项育种技术的发展和应用都具有重要的促进作用,对优良家畜的繁殖和增加畜产品的产量,均具有巨大的经济意义。因此,需要我们研究者的继续努力和政府的大力支持,加快家畜性控技术的研究和推广步伐,这也是家畜生产者所期望的。

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